重组汉坦病毒核壳蛋白抗原诊断肾综合征出血热

【摘要】目的　证实重组汉坦病毒核壳蛋白（rNP）对肾综合征出血热的诊断价值。方法　用大肠埃希菌表达汉坦病毒76118株S基因获得rNP，从该病毒感染细胞裂解液获得天然NP。在相同的捕捉法酶联免疫吸附测定(ELISA)系统中，比较研究rNP与天然NP的抗原功能。用rNP抗原的捕捉法ELISA检测临床血清，与间接免疫荧光（IFA）检测特异性IgG的结果相比较。结果　用rNP和天然NP平行检测116份各类血清，两者符合率达99.21%； 用rNP的捕捉法ELISA检测610份临床血清，结果与IFA的符合率为93.61%。结论　rNP抗原的捕捉法ELISA对肾综合征出血热具有诊断价值。

 

Recombinant nucleocapsid protein of Hantavirus for detecting hemorrhagic fever with renal syndrome

 

TIAN Junxi, WANG Jingjun, ZHOU Yanping, et al.

　　Shanxi Provincial Station of Sanitation and Anti-epidemic, Xi′an 710054, China

 

　　 【Abstract】Objective　To use recombinant nucleocapsid protein (rNP) of Hantavirus as antigen in IgM-antibody-capture ELISA (MacELISA) to detect the specific IgM in hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS).Methods　rNP was obtained from the small (S) genome segment of Hantavirus strain 76118 in Escherichia coli cells and natural NP from the lysis of cultural cell infected by same virus. The antigen effect of rNP was compared with that of natural NP in a same system of MacELISA. The results of clinical sera detected by MacELISA of rNP antigen was compared to those of specific IgG detected by indirect fluoresecent assay (IFA).Results　116 sera from patients with hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS), rheumatoid, encephalitis B were detected with antigen of rNP and natural NP in MacELISA respectivelyce. Their concidence rate was 99.21%. 610 sera of suspected HFRS were tested by MacELISA of rNP antigen with a coincident rate of 93.61% for IFA. Conclusion　rNP as antigen in MacELISA is valuable for the diagnosis of HRFS.

 

　　 【Key words】Hanta virus; Nucleo proteins;Immunoglobulins; Hemorrhagic fever with renal syndrome

 

　　肾综合征出血热(HFRS)是由汉坦病毒引起的急性传染病，其实验室诊断方法主要有IgM捕捉法酶联免疫吸附测定(ELISA)和间接免疫荧光测定(IFA)等技术［1］，所用抗原多来自病毒感染的乳鼠脑悬液或培养细胞裂解液。我们将基因表达的重组该病毒核壳蛋白(rNP)用于捕捉法ELISA，检测可疑HFRS患者，它有使用安全、抗原稳定、效价高等优点，灵敏性和特异性也较好，现报告如下。

 

　　材料和方法

 

　　一、材料

 

　　1.毒株和基因：汉坦病毒76118株为本站冻存；含该病毒S基因全片段的pGS质粒为Schmaljohn［2］构建。

 

　　2.抗体：抗人μ链抗体为Sigma产品。辣根过氧化物酶（HRP）标记抗汉坦病毒核壳蛋白(NP)单克隆抗体由兰州生物制品研究所和第四军医大学提供。

 

　　3.血清：HFRS患者血清49份样本为我站1993～1999年收集；45份健康人血清来自行业体检者；10份类风湿因子阳性血清由陕西省人民医院提供；12份乙脑患者血清为我站收集。

 

　　4.临床可疑HFRS患者血清，共610份，为省内各医院送检的标本。

 

　　二、方法

 

　　1.rNP的制备：用聚合酶链反应从pGS中扩增出汉坦病毒S基因全编码区H1.3S并克隆入pUC18，经鉴定和培养扩大后，亚克隆入pBV220。将该表达质粒转化大肠埃希菌DH5α，32℃培养至对数晚期，42℃诱生8 h。表达菌液离心收菌体，用50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(TrisHCl， pH8.0）、100 mmol/L氯化钠洗涤后重悬，超声破菌，加0.5%辛基酚聚乙二醇醚(TritonX-100)作用10 min后，离心、沉淀，再离心，沉淀用8 mol/L脲溶解数小时，最后对磷酸盐缓冲液(PBS)复性。

 

　　2.感染细胞裂解液制备：汉坦病毒76118株感染Vero-E6细胞［1］，IFA检测病毒强阳性时，将细胞冻融3次，离心收集裂解液。

 

　　3.捕捉法ELISA：抗人μ链抗体用1 mg/L包板，加10 mmol/L PBS（pH7.6）稀释的待检血清100μl/孔，37℃ 30 min后，用含0.05%吐温-20的10 mmol/L TrisHCL（ pH7.4）洗板，加100 μl/孔的rNP（10 mg/L，溶于10 mmol/L pH7.6的PBS，含0.02%吐温-20和5 mg/L的牛血清白蛋白）或感染细胞裂解液（1∶2稀释），37℃ 60 min，再加HRP-抗汉坦病毒NP单抗100 μl/孔，37℃ 60 min，用四氨基联苯氨-过氧化氢显色10 min，2 mol/L硫酸终止反应，在450 nm读吸光度值(A)。其结果≥2.1×阴性标本平均值，判定为阳性，否则阴性。

 

　　4.IFA检测：用76118株感染Vero细胞制作抗原片，操作按文献［1］进行。

 

　　结果

 

　　1.rNP与天然NP的比较试验：分别用rNP和感染细胞裂解液为抗原，在相同的捕捉法ELISA系统中，平行检测HFRS患者、健康人和类风湿因子阳性及乙脑患者血清。检测49份HFRS患者血清的阳性率分别为91.84%和89.80%、符合率为97.96%，健康人及其他患者血清都为阴性，符合率100%。

 

　　2.灵敏性试验：45份IgM抗体阳性血清，用rNP重组核壳蛋白的捕捉法ELISA测定其最大可稀释度，结果平均几何滴度为5 120。

 

　　3.临床血清检测：用重组核蛋白(rNP)的捕捉法ELISA检测610份疑似HFRS患者的血清，与IFA检测特异性IgG相比较，结果ELISA阳性率60.00%，IFA阳性率61.15%，两种方法总符合率为93.61%，其中阳性符合率94.10%，阴性符合率92.83%，经配对χ2检验分析，两种方法差异无显著意义（χ2=0.23 ，P＞0.05）。

 

　　讨论

 

　　早期诊断对HFRS的治疗和降低病死率极为重要［1］。运用基因工程技术制备活性好、效价高、稳定、安全的抗原，有助于HFRS诊断技术的应用和推广。NP是汉坦病毒的主要结构蛋白，对病毒的免疫有重要作用，在感染时机体会产生大量的针对性抗体，被公认对病毒感染的诊断有应用价值［2，3］。对编码NP的S基因片段进行克隆、测序、真核及原核表达的研究，以及证明重组NP与天然NP在抗原性上无明显的差异，为rNP在诊断中的应用奠定了基础。国内有将原核表达的rNP用于间接法ELISA，检测患者特异性IgG［4］和IgM［5］抗体的报道，国外也有相类似的研究［6］。

 

　　我们先用大肠埃希菌表达了汉坦病毒76118株的S基因，将其产物rNP作为抗原用于捕捉法ELISA方法。分别以rNP和感染细胞裂解液（含天然NP）为抗原，在相同的捕捉法ELISA系统中平行检测了各类血清样品，结果两者符合率为99.12%，真阴性率100%，真阳性率分别为91.84%和89.80%，证实rNP与天然NP在捕捉法ELISA中具有相同的功能。再用rNP的捕捉法ELISA检测610份临床疑似HFRS血清的特异性IgM，其结果与IFA检测特异性IgG比较，总符合率是93.61%，其中阳性符合率94.10%，阴性符合率92.83%，经配对χ2检验，差异无显著意义。由于IFA用的是全病毒抗原，所以说明rNP在诊断应用中有与全病毒基本一致的功能，更加证实了该rNP用于捕捉法ELISA对HFRS的诊断价值。

 

　　

作者：田君喜　王敬军　周燕平

参考文献

　　1　宋干，汪诚信，姜克俭，等.流行性出血热防治手册.人民卫生出版社，1987.193-208.

　　2　Schmaljohn CS，Jennigs GB, hay J, et al. Coding strategy of the small genome segment of Hantaan virus. Virology, 1986,155:633-643.

　　3　Schmaljohn CS, Sugiyama K, Schmaljohn AL, et al. Baculovirus expression of the small genome segment of hantaan virus and potential use of the expressed nucleocapsid protein as a diagnostic antigen. J Gen Virol, 1988, 69:777-786.

　　4　梁米芳，李德新，杭长寿，等.汉坦病毒S基因在大肠杆菌中的表达和及其初步应用.中华实验和临床病毒学杂志，1993，7：225-229.

　　5　黄长形，李盈盈，杨为松，等.肾综合征出血热病毒核蛋白在大肠杆菌中表达及产物的初步应用.中华传染病学杂志，1996，14：28-31.