抗真菌药敏试验浓度梯度法与NCCLS方案的比较研究

真菌感染、尤其是免疫低下患者机会性真菌感染发病率的不断上升使真菌病的治疗面临着严峻的挑战。虽然有一些抗真菌药物相继问世,给真菌病治疗带来了新的转机,但同时有关药物治疗耐药的报道也逐渐增多。由于体外药敏试验的主要目的是帮助预测临床抗菌治疗的疗效,如何对抗真菌药物体外敏感性进行恰当的评价已成为一个突出而亟待解决的问题。目前,已经得到批准的美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)M-27A方案[1],经全世界各地多个实验室广泛应用,在采用液体培养基稀释法(包括试管法和微量法)对酵母菌进行抗真菌药物体外敏感试验方案上得到了很好的一致性和稳定性结果。但有关药敏试验与临床疗效的一致性还有待进一步研究。从方法学上,也需要一种临床实验室中更为简便、实用的替代方法。浓度梯度(Etest)法正是近年来在NCCLS方法基础上开发出的一种比较简便、省时、省力的抗真菌药敏试验新方法。自1993年以来,许多学者围绕Etest与NCCLS方案结果的一致性、重复性、识别耐药菌株的作用及与临床疗效的关系方面进行了一系列比较研究,其目的是希望寻找一种结果与NCCLS方案一致,操作过程较之更为简便、快速、直观,更易发现耐药菌株并且与临床疗效更为一致的方法,现将近年来国外对这两种试验方法的比较研究做一综述。

 

一、NCCLS M-27方案与Etest方法

NCCLS M-27方案,即"酵母菌液体培养基稀释法抗真菌药物敏感试验方案",是用液体培养基配制一系列稀释度的药液,然后接种受试菌株的菌悬液,经一定温度孵青后,测定药物在体外抑制真菌生长的最低药物浓度,此方法准确性佳、重复性好,实验室间结果的一致性可以与抗细菌的药物敏感试验相媲美[2]。然而,此方案本身仍存在一些缺陷。首先,此方案仅适用念珠菌等酵母菌,尚不包括丝状菌及双相真菌,培养基不适合新生隐球菌的生长;其次,方法的操作较费时、繁琐;由于真菌生长部分受抑制出现的拖尾现象,而使某些药物终点的判定困难;此外,对于检测一些耐药株特别是两性霉素B耐药株方面也不够敏感。因此,M-27方案仍有待改进[3]。

NCCLS方案的微量稀释法与大量稀释法之间有较好的一致性,且具有操作简便,仅需少量培养基和试剂等特点。已被列入M27-T方案中,但唑类药物的终点判定方法仍不尽人意,缺乏统一的标准,尤其是5-FC和唑类药物的拖尾现象,使结果的判读比较困难且带有主观性[3]。

Etest法是一种新的利用琼脂扩散技术进行的MIC测定法,它已广泛应用于抗细菌药物的体外药敏测定方法[4]。其基本原理是用特殊技术将抗菌药物在一试剂条上形成一个定量连续梯度,其培养基、菌接种浓度、培养温度及时间等条件基本按照M-27方案所推荐的条件。自1993年起开始应用于酵母菌的抗真菌药敏试验[5-7],我国也已取得一些应用该技术的经验[8],其具体操作程序如下。

1.将RPMI 1640+MOPS琼脂(2%葡萄糖)培养基倒入平皿中制成平板备用。

2.用无菌棉签将浊度为0.5McFarland的酵母菌菌液(新生隐球菌菌液浊度为1McFarland)从3个方向均匀涂布于琼脂表面,静置15分钟使平皿表面晾干。

3.将含有药物的Etest条放置于琼脂板表面,注意不要移动试剂条。

4.35℃培养,念珠菌培养24小时,隐球菌培养48小时或72小时。

5.结果判定时读取抑菌环最下端的抗真菌药物浓度作为MIC终点的判定。

由于Etest法在真菌药敏试验中具有简易方便,结果准确等特点,在抗真菌药物的体外药敏试验方面已显示出广泛的应用前景。

 

二、NCCLS方案法与Etest方法的敏感性、一致性比较研究

Etest法最早仅用于细菌药敏的试验,Bolmstrom等在实验室做了许多研究证实该方法同样适用于酵母菌的抗真菌药敏试验。他的主要研究是评价Etest作为一种抗真菌药敏试验工具的可行性。经过反复多次的研究发现严格按照操作程序规定的最佳条件Etest可获得稳定的结果。

自1994年开始有不少学者将NCCLS方案与Etest方法对唑类药物抗真菌MIC的一致性进行了比较研究。Espinel-Ingroff[6]在1994年采用Etest法和NCCLS方案大量稀释法测定了氟康唑、5-氟胞嘧啶对10株质控菌株和78株临床分离酵母菌株MIC值一致性比较研究。结果显示:质控菌株10株有8株MIC值与NCCLS方案结果一致,有较好的一致性。78株临床株,48小时观察结果,两种方法MIC总一致率在氟康唑为81%,5-氟胞嘧啶为94%,有较好的一致性。她认为Etest法是一个很有希望的可在临床广泛推广的药敏试验。Sewell等[7]也在同年测定了氟康唑对238株酵母菌的MIC值并与M-27微量法和大量法比较,结果24小时,Etest法与M-27试管法的结果一致性在光滑球拟酵母菌为37%,热带念珠菌为56%,白念珠菌为93%,而其他念珠菌为90%,总一致率为76%。48小时结果在光滑球拟酵母菌为34%,热带念珠菌为67%,白念珠菌为79%,而其他念珠菌为97%,总一致率为71%。不同菌种所测结果符合率差异较大。Colombo等[9]用Etest法和NCCLS方案多量稀释法测定氟康唑、伊曲康唑、酮康唑对100株临床分离酵母菌的MIC值、MIC值一致率:酮康唑71%、氟康唑80%、伊曲康唑为84%,结果证实Etest与NCCLS液体培养基稀释法有较好的一致性。Wanger等[10]的研究结果表明:Etest方法与NCCLS法一致率达95%~97%,同时发现24小时的结果一致性优于48小时,而且对采用NCCLS方案对两性霉素B耐药性检测不敏感的念珠菌,Etest法也能容易地将其检测出来。VanEldere等[11]也比较了用Etest、NCCLS大量法和比浊微量法测定氟康唑、两性霉素B对念珠菌MIC的一致率。微量法和Etest结果判定在24小时以后。结果发现在两性霉素B,NCCLS多量法与Etest结果一致率达89%,也就是说其终点的差异不高于两个稀释度。NCCLS多量法和比浊微量法之间的一致率为97%。比浊微量法与Etest结果一致率达90%。在氟康唑,NCCLS多量法与Etest结果一致率达96%,NCCLS多量法和比浊微量法之间的一致率为100%,比浊微量法与Etest结果一致率达98.5%。虽然24小时终点的结果变化较大,但与48小时结果比较一致性好,与Wanger等[10]观察结果一致。他还注意到光滑球拟酵母48小时结果,Etest方法MIC值较NCCLS方法要低,但并不象Smel1[7]等所报告的那样低(Smell结果氟康唑对球拟酵母的一致率为37%,而VanEldere结果为93%)。但以前所报道的氟康唑Etest结果普遍比NCCLS方法要低。两性霉素B结果Etest方法也较NCCLS方法低。Espinel-Ingroff等[12]分别采用酪蛋白琼脂和含2%葡萄糖的RPMI 1640琼脂基用Etest法检测伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶、酮康唑和两性霉素B的MIC值,在不同实验室间进行了试验。检测了83株念珠菌、隐球菌和光滑球拟酵母,结果显示:酪蛋白培养基对于两性霉素B、伊曲康唑、酮康唑,实验室间一致性较好,分别为84%~90%;87%,94%~96%。而RPMI 1640培养基对氟康唑和5氟胞嘧啶的一致率较好,分别为96%~98%和80%,说明Etest是很有应用价值的酵母菌药敏试验方法,但仍需要寻找最佳的培养基配方和MIC终点判定标准来提高实验室间的一致性。最近,Pfaller等[13]又用3种不同的培养基Etest法测定了402株临床分离酵母菌对氟康唑的敏感性。结果表明Etest法测定氟康唑药敏最好使用含2%葡萄糖的RPMI 1640培养基或酪蛋白培养基,而不宜使用Mueller-Hinton培养基。

Pfaller等[14]曾用Etest法进行了多中心试验以验证该法的重复性。同时为进一步比较Etest法与NCCLS法的一致性,为Etest检测念珠菌建立质控标准。测定了两株质控菌株热带念珠菌(ATCC22019)和克柔念珠菌(ATCC6258)对两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑和5-氟胞嘧啶的MIC值。在每个试验室重复20次测定每株菌对每个药的MIC值,4个研究室共获得80个MIC值。对此结果进行分析比较,结果的总一致率为98%~100%(在3倍稀释度范围内),两个质控菌株对5种药物用Etest法所得MIC值与NCCLS法所得MIC值完全一致的有:两性霉素B、伊曲康唑对克柔念珠菌,5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑对近平滑念珠菌完全一致,而酮康唑对克柔念珠菌,两性霉素B、酮康唑对近平滑念珠菌的MIC值Etest法略高于NCCLS法(略高1个稀释度)。本研究为Etest检测念珠菌建立了暂定的一个质控标准[14]。

最近,Warnock等[15]为代表的工作小组也对Etest药敏试验进行了多中心观察。共10个实验室参加测试了18株念珠菌和2株新生隐球菌对两性霉素B、氟胞嘧啶、氟康唑和伊曲康唑的药敏性。由两人分别读结果。总的结果,对于两性霉素B,一致率为88.5%,对氟胞嘧啶为94%,氟康唑为92%,伊曲康唑为79%。Etest结果有时将敏感株误归为耐药株,因此,本试验结果认为Etest比较适合念珠菌对两性霉素B和氟胞嘧啶药敏性的常规筛选试验,而用于唑类则不大可靠,如发现唑类耐药株,应用标准方法重新测定。

Velegraki等[16]研究了从粒细胞减少病人分离的白念珠菌各表型与其对伊曲康唑、氟康唑敏感性的关系。共分离出131株念珠菌,其中44株白念珠菌表现出四种表型:光滑型、不规则型、模糊型和点型。无论用NCCLS方案法和Etest法所得MIC值,表型为点型的菌株对氟康唑、伊曲康唑的MIC值都高于其他表型的白念珠菌,说明Etest法与NCCLS方案结果一致,提示临床对点状表型的白念珠菌治疗中要重视有无耐药发生。

Arikan等[17]用Etest、NCCLS微量法、显色法和NCCLS大量法进行比较。采用自免疫低下患者分离的101株念珠菌进行检测。3种替代方法与NCCLS大量法的一致率在两性霉素B为86%~93%,在氟康唑为84%~89%。同时可显示氟康唑对克柔念珠菌和光滑念珠菌的MIC值偏高。

 

三、Etest法在丝状真菌药敏试验方面的应用

为进一步扩大Etest的应用范围,Mills和Wanger[18]研究了用Etest法检测曲霉对5种抗真菌药物敏感性试验,结果显示:全部真菌生长良好,在1~3天内,35℃培养产生了易于辨认的抑菌环,每株菌重复检测MIC值都在2倍稀释度范围内,所有菌株对5氟胞嘧啶、氟康唑耐药(MIC＞32μg/ml),酮康唑MIC值1.0~2.0μg/ml,对伊曲康唑,两性霉素B的敏感性较强,MIC为0.25~0.5μg/ml,这些结果证实Etest有潜力做为丝状菌敏感试验的方法。最近,倍肯公司提供了有关丝状真菌的Etest法实施方案[19],试验菌株包括曲霉、镰刀菌、根霉等,基本操作与酵母菌的Etest法相同,菌悬液的浓度通过比浊法0.5麦氏标准或分光光度计530nm条件下,调整其透光百分比确定,孵育条件为35℃、24~72小时,但是,不同的菌株要求不同的孵育条件,如镰刀菌需在35℃孵育24~48小时,随之室温(约25℃)孵育24~48小时;对于根霉菌属,孵育18~24小时即可,因为孵育时间过长会出现生长过度。该方案同时规定了质控株,但其在丝状真菌方面的应用,有待于进一步扩大受试株,总结经验。

 

四、体外药敏试验结果与临床疗效的关系

众所周知,MIC值与临床疗效之间的关系是非常复杂的,不能单纯根据其MIC值来预测临床疗效,MIC值高低并不一定与临床治疗成败一致。目前多采用动物试驳与临床疗效相结合的方法研究,关于体外药敏试验和临床疗效之间的关系有许多问题亟待解决。NCCLS方案准确性强、重复性好,但还不能将其作为常规的检查方法,不能单纯根据其MIC值来预测临床疗效[3]。早期研究认为在特定的临床条件下,体外药敏试验能预测临床疗效,如接受氟康唑治疗的口腔念珠菌病的AIDS患者,这组人群都患有同一原因所致的免疫缺陷,药物对病原菌的MIC与疗效之间的相关性较好。在比较复杂的情况下,如念珠菌血症病人,受试者本身的条件明显影响临床疗效和MIC检测结果之间关系,Ruhnke等[20]做了NCCLS法与Etest法两种方法敏感性比较及与氟康唑临床治疗疗效的比较研究,结果发现体外试验结果与临床疗效有一定相关性,所有的白念珠菌是来自口腔念珠菌病病人。在较理想的受试条件下临床对氟康唑治疗无效者体外MIC值＞256μg/ml。对氟康唑治疗有效病人分离的白念珠菌MIC值小于耐药标准值,他认为用3种方法所做体外耐药菌株与临床治疗失败是一致的,说明Etest在检测MIC值与临床治疗之间的关系方面与NCCLS方法基本一致。最近,Pfaller等[21]又对Etest对酵母菌对两性霉素B的体外药敏性进行了评价,共采用了660株临床分离株,Etest与NCCLS方法总一致性为98.3%,同时证明Etest方法对发现两性霉素B耐药株较NCCLS方法更为敏感。

综上所述,在迅速进展的体外抗真菌药敏试验中,试验方法的简单化和标准化是研究的热点,NCCLS方案推荐的药敏试验方法对真菌药敏试验的标准化起了巨大的推动作用,但由于它方法繁琐,不适于做为实验室的常规检测项目。而Etest是一个较为简便、可靠、准确的方法,无需特殊条件,可在一般实验室用作药敏检测并可指导临床用药,是一个很有应用前景的临床实验室抗真菌药敏试验方法。

 

参考文献

1 National committee for clinical laboratory standards.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast;Approved Standard M27-A.Lancaster Avenue,Villanova.Pennsylvania:NCCLS,1997.1-12.

2王文莉,王端礼,李若瑜,等.酵母菌的NCCLS药敏试验方法及其应用中华医学检验杂志,1997,20:119-122.

3 Pfaller MA,Rex JH,Rinaldi MG.Antifungal susceptibility testing:technical adnances and potential clinical applications.Clin Infect Dis,1997.24:776-784.

4王辉,陈民均.药敏试验的方法学研究进展.中华医学检验杂志,1997,20:342-345.

5 Bolmstrom A,Karlsson A,Mills K,er al.Antifungal susceptibility testing of yeasts with Etest,abstr 260.In:Program and Abstracts of the 33rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy.Washington D C:American Society for Microbiology,1993.167.

6 Espinel-Ingroff A.Etest for Antifungal susceptibility testing of yeasts.Diagnostic Microbiol Infect dis,1994,19:217-220.

7 Sewell DL,Pfaller MA,Barry AL.Comparison of broth macrodilution,vroth microdilution and E test antifungal susceptibility tests for fluconazole.J Clin Microbiol,1994,32:2099-2102.

8 沈定霞，谢灵，刘梅，等。酵母菌对氟康唑的敏感性及三唑类药敏试验方法的比较。中华医学检验杂志，1998，21：199-201.

9 Colombo AL,Barchiesi F,McGough DA,et al.Comparison of Etest and National Committee for Clinical Laboratory Standards broth macrodilution method for azole antifungal susceptibility testing.J Clin Microbial,1995,33:535-540.

10 WangerA,Mils K,Nelson PW,et al.Comparison of Etest and NCCLS broth macrodilution mehod for antifungal susceptibility testing:Enhanced ablity to detect ampnotericin B-resistant Candida isolates.Antimicrbial Agents and Chemotherapy,1995,39:2520-2522.

11 van Eldere J,Joosten L,Verhaeghe V,et al.Fluconazole and amphotericin B antifungal susceptibility testing by NCCLS broth macrodilution method compared with Etest and semiautomated broth microdilution test.Jclin Microbiol,1996,34:842-847.

12 Espinel-Ingroff A,Pfaller M,Erwin ME,et al.Interlaboratory evaluation of Etest method for testing antifungal susceptibilities of pathogenic yeasts to five antifungal agents by using Casitone agar and solidified RPMI 1640 medium with 2% glucose.J Clin Microbial,1996,34:848-852.

13 Pfaller MA,Messer SA,Karlsson A,et al.Evaluation of the Etest method for determining fluconazole susceptibilities of 402 clinical yeast isolates by using three different agar media.J Clin Microbiol,1998,36:2586-2589.

14 Pfaller MA,Messer SA,Bolmstrom A,et al.Multisete reproducibility of the Etest MIC method for antifungal susceptibility testing of yeast isolates.J Clin Microbiol,1996,34:1691-1693

15 Warnock DW,Johnson EM,Rogers TR.Multi-centre evaluation of the Etest method for antifungal drug susceptibility testing of Candida spp.and Cryptococcus neoformans.BSAX Working Party on Antifungal Chemotherapy.J Antimicrob Chemother,1998,42:321-331

16 Velegraki A,Papalambrou D,Soremi S,et al.Variable antifungal susceptibility of wild-type Candida albicans phenotypes from neutropenic hosts.Eur J Clin Microbiol Infect Dis,1996,15:854-860.

17 Arikan S,Gur D,Akova M.Comparison for Etest,microdilution and colorimetric dilution with reference broth macrodilution method for antifungal susceptibility testing of clinically significant Candida species isolated from immunocompromised patients.Mycoses,1997,40:291-296.

18 Mills K, Wanger A.Susceptibility testing of Aspergillus species using Etest.Etest yeast update,Dalvagen,Solna,Sweden:AB BIODISK,1997.678.

19 AB BIODISK.Etest technical guide 10.Dalvagen,Solna,Sweden:AB BIODISK,1997.171

20 ruhnke M,Schmidt-westhausen A,Engelmann E,et al.Comparative evaluation of three antifungal susceptibility test methods for Candida albicans isolates and correlation wiiith response to fluconazole therapy. J Clin Microbiol,1996,34:3208-3211.

21 Pfaller MA,Messer Sa,Bolmstrom A.Evaluation of Etest for determining in vitro susceptibility of yeast isolates to amphotericin B.Diagn Miceobiol Infect Dis,1998,32:223-227.