幽门螺杆菌空泡毒素研究进展

【摘要】  幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是消化道的主要致病因素之一,与多种胃部疾病密切相关,并被认为是胃炎和胃溃疡产生的病原学因素。空泡毒素(Vacuolating cytotoxin, VacA)被认为是Hp的主要毒力因子,在体外可引起真核细胞形成空泡,因此，VacA的研究成为近年来研究Hp致病机制的新热点,本文对VacA的基因结构、生物学活性、作用机制等方面的研究作一综述。

    【关键词】  VacA；幽门螺杆菌

 

      幽门螺杆菌（Hp）是1983年由Marshall和Warren首次分离得到的一种革兰染色阴性的、螺旋状、微需氧、主要定居在人胃黏膜、引起人类消化道疾病发生发展的重要病原菌。幽门螺杆菌的感染呈全球性分布，其感染率与当地公共卫生状况有关，据报道，在西方国家大约30%～50%的成人感染Hp；在中国，其感染率更高，达50%～80%，并有报道指出人群中感染Hp的比例随年龄增长而提高，而且Hp一旦在人胃内定居，如不采取抗菌治疗，可以持续几十年,严重危害着人群健康。尽管大多数Hp感染者无症状，但有近似10％的感染者患上了胃十二指肠溃疡，胃癌或黏膜相关组织（MALT）淋巴瘤。1994年Hp被WHO定为第I类致癌因子，而其分泌的蛋白毒素VacA作为单一毒力因子可引起靶细胞空泡化、细胞凋亡、细胞骨架重排，最终导致细胞死亡，因此是Hp重要的毒力因子。仅仅发现于1983年的Hp现在是研究得最深入的病原体之一,现就近几年来研究较多的Hp毒力因子VacA综述如下。

 

 

    1  VacA蛋白基因结构和基因型

 

    1.1  VacA的基因结构  T.L.Cover于1993年克隆出了VacA的基因，发现其由3864个碱基对组成，编码1287个氨基酸，编码的蛋白质分子量为139kDa，此为VacA的前体分子，包括三个区域：（1）N-末端为33个氨基酸残基组成的前导信号序列；（2）中间区域为成熟的空泡毒素；（3）C-末端为50kDa的多肽，其氨基酸顺序与许多G＋细菌的外膜蛋白有同源性。在去掉N末端的信号肽，C末端的类似于IgA蛋白酶前体的肽链等修饰后，成为成熟的87kDa的VacA。该活性毒素可降解为37kDa及58kDa两个亚单位。

 

    VacA可能是具有A-B结构的细菌毒素家族，B亚单位与靶细胞表面的膜受体结合并介导A亚单位进入胞浆，A亚单位与细胞内靶分子特异性共价结合后，导致细胞重要功能的破坏，从而发挥毒素活性［1］。

 

    从液体培养上清中提纯的VacA是一个分子量大于900kDa的寡聚复合物，完整的VacA分子呈花瓣状或雪花状，由6～7个沿半径对称的95kDa的VacA单体组成［2］。VacA暴露于酸性pH下可使得寡聚复合物解聚为单体并与VacA细胞毒性的增强有关。

 

    1.2  VacA的基因型  根据VacA5，末端序列的不同，可分为2个不同的类型：s1(包括s1a,s1b2个亚型)，s2；根据中间序列的不同又可分为2个类型：m1和m2。这些等位基因理论上产生的重组体除s2/m1外（推测s2/m1型可能是致死性的），经证实都存在。因此，根据VacA序列的不同可将Hp分为s1/m1、s1/m2、 s2/m2。美国的Hp菌株以s1/m1亚型为主，而中国的则以s1/m2亚型占优势［3］。

 

    2  VacA的生物学活性

 

    2.1  VacA的空泡化作用  VacA诱导细胞空泡形成，这些空泡的膜包含晚期胞内体和晚期溶酶体的标志物［4］。空泡的形成和维持所需的一些细胞内的酶已被证实，这包括空泡ATP酶［5］和小GTP结合蛋白Rab7［6］Rac1［7］。其中空泡ATP酶能够调整通过细胞内间隔膜上的氢离子的流量，因此对于空泡ATP酶的需要提示空泡前体腔内的pH必须是酸性的以便VacA诱导细胞空泡形成。Rab7是调节膜上的离子通道与促进溶酶体融合的GTP酶,位于晚期内体膜上,并且是晚期内体的标志物。支持膜沉积及晚期内体之间的同型融合。而Rac1则控制影响膜运输的细胞骨架成分。即使在检测不到空泡化的情形下，VacA也能改变晚期吞噬途径和溶酶体的功能。有研究显示VacA的空泡化作用受Hp尿素酶的影响，因尿素酶能分解尿素产氨，而氨能促进VacA的空泡化作用。

 

    2.2  VacA干扰组织细胞损伤修复机制  VacA能特异地抑制细胞增殖，延缓溃疡的愈合。最近研究表明VacA参与表皮生长因子（EGF）激活的信号转导通路，Fujiwara等［8］在研究Hp毒素及EGF对胃癌KatoⅢ细胞共同作用的过程中发现，不影响细胞活力的VacA毒素剂量可显著抑制EGF与表皮生长因子受体（EGFr）的结合，并减少EGF刺激引起的细胞增殖达22%。Pai等［9］用EGF作用于胃癌KATOⅢ细胞后，可以增强EGFr的表达及其自身磷酸化，VacA可以抑制上述过程。由上可知,VacA干扰了EGF介导的信号转导通路。可能是VacA与RPTPβ的结合促进EGF受体蛋白酪氨酸的去磷酸化，导致EGF作用减弱，因而干扰上皮修复并延迟溃疡愈合。

 

    2.3  VacA对机体免疫的影响  Molinari等［10］研究了VacA对抗原处理细胞前溶酶体内抗原呈递过程的影响，结果表明，VacA可以特异性的抑制由MHC-Ⅱ类抗原介导的抗原呈递过程，表明VacA可干扰机体保护性免疫而有利于Hp在胃内持续感染，引起相应的临床症状。

 

    2.4  VacA对于细胞功能的其他作用

 

    2.4.1  引起细胞凋亡  VacA能引起线粒体去极化并部分损耗细胞内的ATP，但这在体外试验中对细胞不是致死的［11］。人类的胃细胞对VacA非常敏感，VacA进入线粒体伴随着凋亡，这与线粒体释放细胞色素C和caspase3活化有关，细胞中毒2天后就有细胞死亡。体内的细胞毒实验结果证明还有其他的刺激因素存在，cag＋和表达VacA的Hp株在体内和体外所激发的胃上皮细胞的凋亡率更高［12］。

 

    2.4.2  引起细胞骨架重排  VacA能影响或与细胞骨架的多种成分相互作用引起肌动蛋白重排、Rac-1的改变，而且还能使微管网络解体。这些现象与VacA诱导的细胞增生有关。

 

    2.4.3  其他作用  VacA还能使第二信使产生增加,刺激AGS细胞分泌胃蛋白酶原，增强Hp的侵袭力。不过这些发现还有待于进一步研究。

 

    3   VacA的作用机制

 

    3.1  VacA结合细胞受体  VacA结合到真核细胞表面是细胞中毒的第一步。3种细胞表面蛋白被认为是VacA的受体：（1）AGS细胞表面的140kDa蛋白；（2）HeLa细胞的EGF受体；（3）RPTPβ。在这3种假定的受体当中，VacA与RPTPβ的相互作用已被证实。

 

    s1/m1型VacA能引起许多不同细胞的空泡化，因此认为其能有效的结合这些细胞系。相反，s1/m2型VacA也能引起一些细胞系的细胞产生空泡而对另一些则作用甚微。这表明s1/m1型VacA和s1/m2型VacA结合的细胞类型不同，因为它们之间的主要区别在于p58的C－末端，提示毒素结合细胞所需的氨基酸序列位于p58内［13］。p58的抗体能抑制VacA结合HeLa细胞，而且GST-p58融合蛋白能结合HeLa细胞。

 

    3.2  VacA－膜相互作用  研究表明［14］活化的VacA能插入脂质体膜而未活化的VacA却不能，此相互作用引起离子和荧光分子的释放。低pH活化VacA引起疏水端暴露的增加，因为低pH活化与可溶的VacA寡聚体解离为单体有关，以前隐藏的疏水端的暴露可能涉及到膜的插入。属于VacAp37的三个区域在膜插入后变得能抵御蛋白酶的消化，这提示此三个区域不是插入脂质双层就是转位到脂质体膜腔，大部分p58留在膜外。

 

    3.3  VacA的内化  VacA结合到细胞表面之后慢慢的内化。p58介导的表面受体的结合对于接下来中毒的步骤来说是远远不够的。事实上，一个仅含p58的缺失变异的VacA能结合细胞但不能内吞［15］。因此，在毒素内化过程中可能存在其他的相互作用，或是由p37N－末端介导的，或是依赖于VacA的寡聚化［16］。内化是细胞空泡化的必要步骤。

 

    3.4  VacA在细胞内的活性  VacA内化后提示其能在内化位点发挥毒性作用。为测试这个假设，HeLa细胞被转染了编码VacA的质粒，当其在胞质中表达时，VacA诱导的空泡形成与外加的VacA诱导的空泡性质一样［17］。免疫荧光分析显示细胞内表达的VacA以一种可溶的形式存在于胞质和正在空泡化的腔室中。Galmiche等［18］报道表达在HEp－2细胞质的全长VacA和p34能迁移到线粒体基质，而p58却保留在胞质中，这些证据表明VacA进入细胞质后能进一步转位通过线粒体膜。

 

    3.5  离子通道的形成  实验显示插入脂质双层的酸活化的VacA能引起通道形成，而此通道是具离子选择性的。大多数学者认为通道的形成在VacA诱导典型的空泡形成中起了直接的作用,可能原因是内化的毒素在晚期胞内体间隔上形成阴离子选择性的通道,对阴离子渗透性的增加会增加空泡型ATP酶的作用,从而导致CL与具有渗透性的胺盐在胞内体腔中积聚,进而导致胞内体的肿胀与融合,最后形成空泡。抑制实验显示阻碍VacA通道形成的复合物同样抑制了空泡的形成，而且有效性相同，这充分说明了VacA的孔形成活性是其细胞毒性所必需的。Szabo等［19］进一步证实了VacA能增强Hela细胞膜上的离子选择性通道,并使其去极化。VacA的氨基末端亲水区能促进毒素的插入，因此缺失了氨基末端的VacA既不能诱导空泡形成也不能形成通道，蛋白分析也显示p34对于通道的形成起重要作用。

 

    4  VacA的临床意义

 

    4.1  VacA的临床相关性  1989年Figura［20］等比较了从77例胃溃疡病人和胃炎病人中分离出的Hp菌株的细胞毒素的产生。他们发现从胃溃疡病人当中分离出的菌株66.6％能产生细胞毒素，而从胃炎病人中分离出的只有30.1%,这种显著的差异表明细胞毒素可能与胃溃疡的产生密切相关。此外，Atherton［21］等发现了vacAs1基因型与胃溃疡的重要相关性。vacAs1基因型与胃癌也具同样的相关性。

 

    4.2  VacA作为未来疫苗的前景  Hp能定居在小鼠的胃内，Ⅰ型菌株的感染可引起与人类疾病相似的胃部病变，使用纯化的VacA和E.coil不耐热肠毒素作为佐剂免疫这种小鼠模型可保护其免遭Ⅰ型菌株的感染。说明VacA有免疫原性，可作为预防Hp感染的疫苗。

    从Hp培养上清液中高度纯化的VacA有生物学活性，免疫家兔后可诱导家兔产生中和抗体。其血清研究显示其包含大部分能够识别构象表位的抗体。说明空泡毒素在体内有构象变化,因此针对VacA的免疫应答的建立依赖于VacA天然的构造，针对重组VacA的抗血清不能中和空泡活性，而且也不能识别天然的VacA，那么对于这种空泡毒素的疫苗只有使用完整的分子才可能有效。但是由于聚集的问题，尚未合成有活性的VacA，但是天然的VacA能通过甲醛脱毒，甲酰化的VacA仍然能够结合靶细胞，但没有空泡活性，尽管其诱导产生的中和抗体与天然未经处理的VacA诱导产生的相比有一些改变但仍被成功地应用于保护实验当中。

    对于Hp疫苗的各项研究预示，随着对VacA构象（单体分子的聚集）问题的解决，VacA很有可能成为预防和治疗Hp感染的有效疫苗。

作者：郑筱雯（综述），李玉虎（审校）

作者单位：1 330006 江西南昌,南昌大学医学院研究生部

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