中药提取物对龙胆叶枯病病原菌抗菌活性的筛选

【摘要】  　　目的筛选抗龙胆叶枯病菌活性的中药。方法以龙胆叶枯病菌（Alternaria sp.）为供试菌种，对9种中药乙醇提取物进行抗龙胆叶枯病菌活性实验，采用有限稀释法，测定最低抑菌浓度。结果9种中药乙醇提取物均有抑菌作用，其中蛇床子、川楝子提取物14 d的最低抑菌浓度MIC100小于0.1 g/ml。结论蛇床子、川楝子具有较强的抗龙胆叶枯病菌作用，可进一步开发为防治龙胆叶枯病药物。

【关键词】  中药杀菌剂 抑菌作用 活性筛选 龙胆叶枯病

　　Abstract:Objective  To screen the antifungal activity against Alternaria sp. of TCMs. MethodsThe antifungal activity against Alternaria sp. for the ethanol extracts of nine speices of TCMs was tested on Alternaria sp. Use limiting dilution to test the minimum inhibitory concentration.ResultsAll the ethanol extracts of TCMs exhibited inhibition on Alternaria sp.. The minimum inhibitory concentration of Fructus Cnidii, Fructus Tossendan was under 0.1 g/ml. Conclusion The antifungal activity of Fructus Cnidii, Fructus Toosendan against Alternaria sp.. is much stronger and can be developed.

　　Key words:Fungicides of TCMs；  Inhibition；  Screening；  Rough gentian

　　龙胆叶枯病（Alternaria sp.）是龙胆生产中的重要叶部病害，发生普遍。在龙胆及其它药材生产中对病害的防治大量使用化学药剂，导致环境污染、农药残留，影响药材的质量。我国中药资源丰富，许多中药含抑菌活性物质［1～3］，从中寻找抑制植物病原菌活性物质，研制植物源新型杀菌剂，防治药用植物病害，对生产符合GAP标准中药材具有重要意义。

　　目前，国内外学者在中草药抗真菌实验方面已做了大量的工作 ［1～5］，而从中筛选抗药用植物病原真菌的研究较少。本研究根据以往中药抗真菌文献报道，选出9种中药，研究其对龙胆叶枯病菌（Alternaria sp.）的抑制作用。

　　1  材料与方法

　　1.1   材料

　　1.1.1  中药 

　　地肤子、苦参 、知母、川楝子、蛇床子、大风子、苍耳子、白鲜皮、土槿皮购于哈尔滨市同泰大药房，经鉴定为正品； 95%乙醇（天津泰达化工有限公司），葡萄糖（沈阳市试剂三厂），琼脂（青岛水产品加工厂）。

　　1.1.2   供试菌种

　　龙胆叶枯病菌,从黑龙江北安栽培的粗糙龙胆Gentiana scabra Bunge中分离纯化得到，采用从病组织分离培养，将分离得到的菌种接种到PDA培养基上培养［6］，待产生孢子后，采用单孢分离的方法对菌种进行纯化。应用柯赫氏证病法则（Kochˊs postulate）证明为龙胆叶枯病病菌，通过对分生孢子梗、分生孢子等的观察鉴定为Alternaria sp.。

　　1.1.3  培养基 

　　用PDA培养基。

　　1.2  方法

　　1.2.1  样品的制备

　　将中药样品于60℃烘干，经粉碎过20目筛，加5倍量的95%乙醇回流提取两次，2 h/次，滤过，滤液减压浓缩至1 g/ml（即每毫升含1 g生药）。浓缩液于冰箱（0～4℃）冷藏备用。

　　1.2.2  菌种活化

　　将保存的菌种接于PDA培养基上培养4d备用。

　1.2.3  抑菌实验  

　　在无菌操作条件下，以1 g/ml生药的药液为原液，用灭菌PDA培养基稀释，分别 稀释为原液的50% ，40% ，30% ，20%，10% ，5%，1% ，0.8%，0.6%，0.4%，0.2%，0.1%（相当于每毫升含0.5，0.4，0.3，0.2，0.1，0.05，0.01，0.008，0.006，0.004，0.002，0.001 g生药）12个浓度的药基，对照为70%乙醇代替药液配制，并控制药基中的乙醇含量在15%以下（在配制高浓度的药基前，对加入的药液挥去部分乙醇），每管接种新培养的真菌菌落边缘2 mm2的真菌菌丝块，重复3次，25℃培养。每天观察接种菌落生长情况，凡生长的菌落记为“+”，凡完全不生长的菌落记为“-”。

　　1.2.4   MIC100的确定 

　　MIC100为杀真菌剂(fungicide)的最低抑菌浓度，菌种接种在每种药物系列梯度浓度培养基上，恒温箱中培养7 d 和14 d，用肉眼观察，接种菌块未扩大，无细胞生长，取完全不生长管最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。

　　2  结果

　　抗菌实验结果见表1。表1  9种中药乙醇提取物对龙胆叶枯病菌（Alternaria sp.）的抑制作用（略）

　　由表1给出各中药乙醇提取物的最低抑菌浓度，结果见表2。表2  中药乙醇提取物对龙胆叶枯病菌（略）

　　结果表明，9种中药乙醇提取物对龙胆叶枯病病菌（Alternaria sp.）均有不同程度的抑制作用，随着培养时间的延长，抑菌作用逐渐减弱，培养7 d最低抑菌浓度MIC100≤0.2 g/ml有地肤子、蛇床子、白鲜皮、川楝子、大风子，最低抑菌浓度MIC100≤0.1 g/ml有蛇床子、白鲜皮、川楝子；培养14 d最低抑菌浓度≤0.2 g/ml有川楝子、蛇床子、大风子，培养14 d 最低抑菌浓度MIC100为0.1 g/ml有川楝子、蛇床子。将药基上的菌种转接到无药PDA培养基上仍不能生长，表明真菌已被杀死，川楝子、蛇床子乙醇提取物有较强抗龙胆叶枯病菌（Alternaria sp.）作用，其次为白鲜皮和大风子，可进一步作田间实验。

　　3  讨论

　　用乙醇提取抗菌活性物质优于水提法［4，7］。本实验采用乙醇回流提取法，有利于生物碱等生物活性物质的提取，同时减少了提取液中蛋白质、多糖等杂质。

　　本实验采用在药基上接种菌丝体的方法测定药物抗真菌活性，属于固体琼脂筛选抗真菌药物，并采用有限稀释法测定MIC100，该法操作简便。前人实验多采用培养基与药物同时灭菌的方法，本实验在药基配制时，仅对培养基进行高温灭菌，冷却至70℃左右用微量移液器加入药物，药物有效成分不被破坏，在经长时间培养未滋生杂菌，实验方法可靠。

　　由真菌引起的病害防治困难，只要有部分真菌细胞不被杀死，在适宜条件下就能生长繁殖，因此本抗菌实验以真菌生长完全受到抑制来评价抑菌效果,即在较长时间(14 d)仍能保持对真菌生长的抑制，才是理想的抗菌药物。9种中药经长时间抑菌试验观察，川楝子、蛇床子乙醇提取物对龙胆叶枯病菌抑菌作用强而持久，是理想的抗龙胆叶枯病真菌的中药。白鲜皮在培养7 d时抑菌作用最强，虽然到14 d时抑菌作用有所下降，也是一个较理想的抗真菌药物。有待对其抗菌机理进一步研究。

作者：孙海峰 王喜军 王苏艳 杨婷《》

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