杆状病毒基因组的结构和功能研究

1.杆状病毒基因组的结构和功能研究

杆状病毒基因组为双链环状 DNA分子。DNA以超螺旋方式被压缩包装在杆状核衣壳(rod.shaped nueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜(envelope)后形成病毒粒子。核衣壳包括衣壳(capsid)蛋白和髓核(COle)。其中衣壳蛋白是杆状病毒粒子的主要结构蛋白；髓核由病毒DNA分子和与其密切相关的碱性蛋白构成。碱性蛋白同DNA紧密结合以维持其复杂有序的超螺旋结构。

目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)b]、家蚕核多角体病毒(BmNPV) 、黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒(OpMNPV)、舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒(LdMNPV) 、甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒(SeMNPV)、棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)，以及斜纹夜蛾核型多角体病毒(SphMNPV)。

目前AcMNPV基因组的研究最为深入，它是双链超螺旋大分子环状DNA，其大小为90～160kb，约编码154个基因。AcMNPV基因组的基因组织(gene organization)较为复杂，基因组的不同区域具有功能分化，基因的分布尚无规律可循，但AcMNPV基因组含有8个同源区，每区含有不等的重复或倒置重复序列，这些重复序列由位于中间的不完整回文序列及其两侧各约20bp的序列构成。同源区是杆状病毒基因组普通存在的功能域结构，对于基因表达的调节具有增强作用，同时也是 DNA复制的原点。

杆状病毒中现已鉴定的基因近70种，可分为结构蛋白基因和非结构蛋白基因两大类。结构蛋白基因如 polh、P10、gp64、p6.9、gp41、vp39等基因。非结构基因中，与DNA复制相关的重要基因有helicase基因(he1)、dnapol、lef-1、lef-2、lef-3、ie-1、/ie-2、p35、pe-38等；起表达调节作用的基因主要有 ie-1、ie-2、lef类基因、p35、pe38等。这些代表性基因与其功能的关系见表1。

 

2．杆状病毒载体表达系统的特点

AcNPV病毒用作外源基因的表达载体，通常是通过体内同源重组的方法，用外源基因替代多角体蛋白基因而构建重组病毒。由于多角体基因启动子在感染后18~24h开始转录和翻译，一直持续到70 h。外源基因置换掉多角体基因后，并不影响后代病毒的感染与复制，意味着重组病毒不需要辅助病毒的功能。

杆状病毒表达系统自从第一次用来表达干扰素以后在许多重组蛋白的表达中得到广泛应用，例如用于表达白介素(IL)一2，3、BMP及多种病毒蛋白等。相对其他表达系统它具有以下几个方面的特点：

①重组蛋白具有完整的生物学功能：杆状病毒表达系统可为高表达 的外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物的形成提供良好的环境，可使表达产物在结构及功能上接近天然蛋白。

②能进行翻译后的加工修饰：杆状病毒表达系统具有对蛋白质完整的翻译后加工能力，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等，修饰的位点与天然蛋白在细胞内的情况完全一致：对比实验证明，在昆虫细胞发生的糖基化位点与哺乳动物细胞中完全一致，但修饰的寡糖种类却不完全一样。这种不一致对不同目的蛋白的活性影响不同，所以昆虫表达系统还可作为一个研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方面的理想模型。

③表达水平高：与其它真核表达系统相比较，此系统最突出的特点就是能获得重组蛋白高水平的表达，最高可使目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50％。

④能容纳大分子的插入片段：杆状病毒毒粒可以扩大，并能包装大的基因片段，但目前尚不知杆状病毒所能容纳的外源基因长度的上限。

⑤能同时表达多个基因：杆状病毒表达系统具有在同一细胞内同时表达多个基因的能力。既可采用不同的重组病毒同时感染细胞的形式，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因，表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体。另外，昆虫杆状病毒表达系统具有剪切的功能，能表达基因组DNA；还有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等。最后，杆状病毒对脊椎动物无感染性，现有研究也表明其启动子在N-％动物细胞中没有活性，因此在表达癌基因或有潜在毒性的蛋白时可能优于其它系统。

3．杆状病毒载体的重组与筛选

杆状病毒由于基因组庞大，外源基因的克隆不能通过酶切连接的方式直接插入，必须通过转移载体的介导．即将极晚期基因(如多角体基因及其边界区)克隆入细菌的质粒中，消除其编码区和不合适的酶切位点，保留其5’端对高效表达必需的调控区，并在其下游引入合适的酶切位点供外源基因的插入，即得到转移载体。将要表达的外源基因插入其启动子下游，再与野生型AcNPV DNA共转染昆虫细胞，通过两侧同源边界区在体内发生同源重组，使多角体蛋白基因被外源基因取代。而将外源基因整合到病毒基因组的相应位置，由于多角体基因被破坏，则不能形成多角体。这种表型在进行常规空斑测定时，可同野生型具有多角体的病毒空斑区别开来，这就是最初的筛选重组病毒的方式。但由于重组效率较低(0.1％-1％)，表型差别不显著，应用上有一定的困难。为此，经过不断探索，在重组杆状病毒的筛选与鉴定方面取得了很大改进，具体方法有以下几种。

3.1．半乳糖苷酶的蓝白筛选

1990年，Vialard等在多角体基因的上游，利用pl0基因启动子带动LacZ基因构建了转移载体pJVNheI。将其共转染sf细胞后，重组病毒可表达B-半乳糖苷酶，通过加入x-gal使之形成蓝色空斑，便可进行重组病毒的筛选。1990年，Kins提出了线形化技术，其原理是线形化的杆状病毒基因组感染性很低，但仍具有与引入细胞内的同源序列进行同源重组的能力。如果同源序列位于线形化杆状病毒的两端，则基因组即可环化恢复完整的感染性，使阳性重组率大大提高。

3.2．体外酶促定位重组

Cre-Loxp系统最早由Sternberg等最早建立，噬菌体Pl含有1个重组位点Lox(1ocus of(rossover)和1个Cre酶基因，其产物(Cre酶)为重组所必需：Cre酶已被克隆纯化；Lox序列已被测定由34个核苷酸组成，其两端为13 bp的反转重复序列。中间为8 bp的非回文序列。将此序列引入AcNPV基因组即得vAclox，转移载体引入lox后可获得plox。vAclox和 plox在Cre酶存在条件下，两者即可发生体外定点重组，而将载体上的相应序列转到病毒的基因组中(这是1个可逆酶促反应)，将反应混合物转染草地夜蛾(spodoptera frugiperda)sf细胞中，即可得到高比例的重组子代病毒。这个方法的特点是体外重组，通过控制反应的条件可达到很高的重组率。但由于重组是位点特异性的，反应产物往往是转移载体多次插入亲代病毒的结果，因而要进行多轮空斑实验纯化病毒。

3.3．Bacmid

后来Luckow等又发明了一种新的杆状病毒重组技术。他们根据 F因子载体原理，用类似于酵母体内重组的方法，构建了一种新杆状病毒穿梭载体Bacmid。该载体可像质粒一样在大肠杆菌中生长，又对鳞翅目昆虫细胞具有感染性。Bacmid含有F因子复制子(可在大肠杆菌中复制)、卡那霉素抗性基因及Tn7转座位点attTn7。转移载体中，外源基因置于杆状病毒启动子之下，两端分别为Tn7的左右端。以其转化含Bacmid的E coli菌株，由辅助质粒提供反式作用发生转座，而将外源基 因转到 Bacmid的attTn7位置。这种重组了外源基因的 Bacmid转染的昆虫细胞 ，可得到 100％阳性重组病毒。这种方法都是在大肠杆菌中进行的，非常简便，由于没有本底干扰 ，同样不需进行空斑纯化。缺点是 F因子提取不很方便，其稳定性也有待于观察 。

3.4．TK基因

胸苷激酶可将核苷类似物转变成的有毒的中间体而抑制病毒的复制。该核苷类似物作为疱疹病毒编码胸苷激酶(HSV—TK)的底物，能特异性地抑制单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和EB病毒的复制。由于这些类似物对病毒的胸苷激酶有高度的选择性，而细胞 自身胸苷激酶对这些类似物的结合常数很低 ，故能选择性地杀死表达 HSV-TK基因的细胞。

3.5．Neo基因

Neo是经典的显性选择标记，这是一种细菌编码的磷酸转移酶基因，可使氨基糖苷类抗生素 G418失活。后者又是一种蛋白质合成抑制剂，可干扰真核细胞80S功能。Neo曾被引入几种脊椎动物病毒(如痘苗病毒和EB病毒)的基因组中，作为选择标记。1989年，Jarls将Neo引入sf细胞染色体中而得到 G418抗性的细胞系，说明Neo可作为选择标记用于重组病毒的筛选。本方法和TK基因相比较略显繁琐，需经连续传代，但其不用改造辅助病毒，只需在转移载体中引入Neo基因即可。其它如 PCR、DNA斑点杂交及有限稀释法等，也可用于筛选重组病毒。以上方法各具特点。虽然有些新方法需一定的条件，但一旦建立起来后就可方便、迅速地得到重组病毒，为杆状病毒表达系统的普及应用创造了良好的条件

4 ．影响外源蛋白表达的因素

利用杆状病毒昆虫表达系统表达外源基因的理论基础，就是杆状病毒的基因表达与调控，但有关病毒晚期基因高表达和其调控机制目前还不十分清楚。利用多角体基因的启动子表达外源基因，影响表达水平的因素除与病毒本身的因素有关外，还与受感染细胞的种类和生理状况乃至培养基的质量有关。

4.1．病毒的稳定性

杆状病毒在细胞中多次传代后，可能引起基因组的变化。最明显的变化就是形成ov的能力 降低。由于细胞间不需要ov形成感染，只需通过BV病毒感染即可。多次传代的病毒也可能出现少多角体(few polyhedfin，FP)表型的变化，一般每个感染细胞只含有10个多角体病毒。其中突变病毒多角体的表达水平也有所降低，应用这种突变病毒会对外源基因的表达带来不利。若重组前病毒是变异FP，通过肉眼分辨重组与非重组病毒时，有可能发生假象。另外，长期多次传代的病毒也往往引起表达水平的降低，为避免上述情况的发生，要限制病毒的传代次数，一般控制在2-3代以内。

4.2．在昆虫细胞内表达与幼虫体内表达

虽然目前大部分工作是在细胞培养条件下进行的，当需要大量制备某类表达产物时，最好采用昆虫蛹。因为培养昆虫幼虫远比培养细胞简单、便宜，而且在昆虫体内培养可以提高表达量。一般在幼虫体内的淋巴液中，蛋白含量较在细胞培养基中高l0倍以上，例如小鼠IL-3的表达量在淋巴液中较在细胞培养上清中高500倍，可能是细胞培养基中含有的蛋白酶使之降解所致。

4.3．启动子类型

在构建转移载体时，使用不同的启动子就需构建相应的同源序列。目前最常用的启动子有晚期Polh(polyhedrin)启动子和P10启动子，还有碱性启动子以及少数早期启动子。同一目的基因在不同启动子控制下，表达水平会有很大差异。研究发现，分泌类蛋白使用PIO启动子或碱性启动子的效果更好。

4.4．外源基因序列的本身因素

能在重组杆状病毒有效表达的外源基因5’端及3’端非编码区越短越好，一般长度在3～400个核苷酸以内。影响表达的其他因素包括：密码子的使用情况(是否为昆虫细胞所常用)、mRNA的稳定性及蛋白质的稳定性等。外源基因附近的序列很重要。Kozak分析了数百个真核序列，得出两点结论：首先，启动子下游第1个ATG常作为起始密码子；其次是在 ATG附近的序列并不是随机的。有95％表达的真核基因在ATG前-3位是嘌呤(而且常是A)，+4位是G。如果-3的A或+4的G有1个被嘧啶替代，翻译水平就下降5~l0倍。如果-3位和+4位均被嘧啶所替代，翻译水平就下降20倍。因此，Kozak提出，(GCC)GGC A／GCC AUG G是高等真核基因起始密码附近的保守序列，其中-3处A最为保守。

4.5．重组病毒基因的表达与调控

多角体启动子控制的外源基因的表达，紧靠上游的序列对基因的转录调节是最重要的。许多研究表明，当外源基因5 端加有1～58个多角体蛋白的氨基酸序列以融合蛋白形式表达时，效果最好。用高、中与低3种表达的外源基因进行实验的结果表明，保留一部分多角体5’端序列与外源基因以相同的框架相融合，表达水平最高；如果框架不同，那么从距启动子最近的起始码开始翻译，表达产物水平相对偏低。