微生物室常用的病原真菌检查方法

1、真菌镜检

是最简单也是很有价值的实验室诊断方法。其优点在于简便、快速，无菌部位的阳性结果可直接确定真菌感染。但是由于阳性率较低，阴性结果亦不能排除诊断。直接镜检对于浅表和皮下真菌感染最有帮助。在皮肤刮屑、毛发或甲标本中发现皮肤癣菌、念珠菌和马拉色菌的成分可提供对相应真菌病的可靠诊断。如在无菌体液的 直接镜检中发现真菌成分常可确立深部真菌病的诊断，例如在脑脊液中检测到带荚膜的新生隐球菌酵母细胞，或外周血涂片中检测到荚膜组织胞浆菌细胞。但一般在有菌部位则只有发现大量真菌菌丝方才有意义，通过直接镜检一般可以区分念珠菌、隐球菌、暗色真菌、毛霉（接合菌）等菌的感染，进一步明确鉴定菌种需要通过 培养鉴定来完成。

2、真菌培养

真菌培养是实验室检查中的重要环节，培养出致病真菌是进一步鉴定菌种的前提条件。真菌培养第一步是从临床标本中培养真菌的初代培养，初代培养后进一步进行分离纯化培养和鉴定培养。不同致病真菌每一步所采用的培养基，培养时间和培养温度存在一定的差异。常规的真菌培养需要在28-30°C温度下培养3-4 周，一般初代培养选用沙氏培养基（SDA）或者马铃薯琼脂培养基（PDA），采用试管培养，一般同时培养两管，其中一管可添加抗生素（氯霉素或庆大霉素均 可）。在培养1周内，应该每天观察有无真菌生长。一般培养4周后，如果无真菌生长可报阴性。发现培养出真菌，直接挑取少量菌体或者小培养后，用乳酸酚棉兰制成涂片显微镜下观察，结合菌落大体形态，典型菌种可直接报告种属。不典型菌种根据基本表现，采用适当的标准鉴定培养基，标准培养条件培养，必要时要结合 生理学和分子生物学方法进行鉴定。

    3、真菌鉴定

    对常见致病真菌要掌握的鉴定原则是首先区分酵母菌和霉菌。

    如果初代培养基上培养出酵母样菌落，在鉴定前应进行分离纯化。在去除细菌和其他真菌污染，区分混合感染后，对纯菌落进行鉴定。酵母菌鉴定主要根据形态学特征和生理生化特点，按照一定的流程进行。首先根据菌落颜色进行分类。临床最为常见的是白色或奶白色菌落，这类菌进一步做芽管试验，若芽管试验是阳性则为白 念珠菌，若阴性则通过Vitek YBC或API20C及玉米吐温琼脂上培养的形态特征来鉴定。另外，还可以应用念珠菌显色琼脂、尿素酶试验等试验来辅助鉴定。

    霉菌的鉴定非常复杂，有许多标准包括形态学特征、温度耐受性，放线菌酮抗性、双相性、营养需求、蛋白分解活动以及水解尿素能力等。现代分类学鉴定方法主要依据分生孢子的个体发生过程结合其他特征来进行鉴定。初代培养后根据形态学特征一般可鉴定到属的水平，再依据不同真菌的鉴定要求，采用标准培养基和培养条 件进一步完成菌种鉴定。例如：曲霉属鉴定时需要采用标准培养基，即察氏培养基和麦芽琼脂，25℃培养7天后与曲霉形态鉴定检索表对应得到正确的结果。

    （一）形态学鉴定

    1、菌落形态观察  致病真菌的形态学鉴定的第一步就是要区别不同的菌落特征。即酵母型菌落或丝状型（霉菌）菌落。对霉菌通常采用形态学鉴定为主, 而酵母菌常需采用形态和生理相结合的手段。观察真菌菌落时应注意菌落大小、形态、色素、颜色和质地。

    2、显微镜检查  为充分在镜下观察真菌结构，必须用分离针挑出一部分菌落进行观察。常用乳酸酚苯胺蓝(LPCB，棉蓝)对挑取的部分菌落进行染色。此项操作必须在生物安全柜中进行。样本需要保存时可用指甲油封边。小培养、覆盖培养、透明胶带法等均是常用的方法。

    3、玻片培养  是一种特殊的玻片作成的培养小室，可以更为清楚地观察真菌孢子和分生孢子的形成及位置。涉及小培养的所有操作均应在生物安全柜中进行。可选用马铃薯琼脂、玉米琼脂或V-8果汁做培养基。

    4、透明胶带法  用透明胶带粘取菌落表面置于镜下观察，是一种不破坏分生孢子结构的快捷方法。

    5、电镜观察  透射电镜(TEM)用来观察真菌的断面，横隔的差别、各种细胞器、细胞壁等结构。扫描电镜（SEM）用来观察真菌的表面结构，特别是产孢特点。

 

    用表型特征对真菌进行分类鉴定，仍然是目前临床实验室普遍应用的方法。对致病真菌的鉴定，需要选择合适的培养基进行培养后，再借助光学显微镜，加上荧光显微镜、电子显微镜和细胞化学等各种染色法观察形态特点。

    （二）分子生物学鉴定

    应用分子生物学技术从遗传和进化角度阐明真菌菌种之间和种间内在关系是目前真菌分类研究热点，已普遍应用于真菌现代分类鉴定之中。

    常用的分子生物学鉴定方法包括：真菌DNA 硷基组成（G+C Mol%）、限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、Southern 印迹、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、rDNA序列测定等。由于生物多样性的缘故，分子生物学的研究有4种目的：①系统发生研究；②分类学研究，主要在属、种水平；③鉴定应用，即决定明确的分类名称；④流行病学和群体的遗传学研究。

DNA序列测定是目前最引人注目的发展方向，已成为致病真菌的分类鉴别的重要手段。目前应用最多的为rDNA序列、几丁质合成酶、细胞色素P450 L1A1基因，细胞色素氧化酶C和细胞色素B等基因序列。 

    （三）生理学和生物化学方法  在纯培养上真菌生长比较快，可以使用生理、生化方法来鉴定菌种，多用于酵母菌的鉴定。测定真菌的不同生长温度的温度试验也用于鉴定。对碳水化合物的利用能力是酵母菌鉴定的主要手段，目前已有商品化的API系统，也可用于丝状真菌的辅助鉴定。

 

    此外，微生物自动鉴定系统Vitek、autoSCAN-4、Biolog和MIS等自动鉴定系统，可以较满意地鉴定临床上常见的病原性酵母菌。   

    虽然经典检查方法是真菌检查的基础，虽然操作简便但存在着敏感度低，耗时长等不足。近年来，除经典的真菌学方法以外的非培养检查方法在真菌感染诊断，特别是侵袭性真菌病方面发挥了重要作用。这些方法主要包括血清学检查、和分子生物学检查等。     1、血清学方法检测真菌抗原成分

    念珠菌感染和曲霉感染的血清学检测可分为抗体检测和抗原检测两大类；由于发生侵袭性真菌病的免疫受损宿主往往缺乏可检测到的抗体，或者抗体的产生变化较大，因此检测抗体对于系统性真菌感染的诊断意义不大，而目前用于临床的血清学检查主要属于后者，即检测血液循环中的抗原；常用的有下述几种：

    （1）、β-D-1,3葡聚糖（BDG）：是许多真菌细胞壁的主要成份，如念珠菌、曲霉、镰刀菌等，但不包括隐球菌和接合菌；由于细菌、病毒、哺乳动物无这种成份，因而在循环血液中测得时则提示侵袭性真菌感染，目前已经有商品化BDG检测的试剂盒。BDG的检测，在2小时内可以获得结果，因此尽管不能区分 真菌感染的种类，但是仍然具有重要作用，美国FDA已经批准Fungitell用于真菌感染的诊断，国内也有相似试剂问世，目前在临床应用中。

    （2）、半乳甘露聚糖（GM）：GM是存在于曲霉和青霉细胞壁的一种热稳定的多糖，可用于侵袭性曲霉病的临床诊断。可以使用血清和支气管肺泡灌洗液检测 GM，近来也有人使用尿液和脑脊液等标本检测。GM检测的敏感性为29-100%，而其特异性可超过90%。由于GM量的多少与组织中真菌含量密切相关， 因此检测GM还可以提示疾病的预后。

    2、分子生物学检测：

    由于真菌培养和鉴定需要的时间较长，阳性率较低，因此与分子生物学相关的从临床标本直接检测真菌的技术和方法也在不断发展中，最为活跃的当属PCR技术， 具有快速、敏感等特点。PCR技术可以扩增血清、血浆、全血、尿液、痰液、支气管肺泡灌洗液和脓液等标本中的真菌成份。在进行扩增之前，应当对标本进行处理以去除影响扩增效率的一些因子。所扩增的靶序列有多种，但是应用较多的还是 rDNA的ITS1和ITS2区域；与培养相比，ITS-PCR检测血标本中念珠菌的敏感性与特异性可以达到100%。在PCR扩增检测中，有传统的 PCR方法，也有巢式PCR法，最近应用较多的是实时定量PCR方法，其敏感性和特异性较好，在临床有应用前景