中华人民共和国轻工行业标准——皱纹纸(节选)之二

　　于同一批号的三个大包装中至少随机抽取15包小包装样品，三分之一用于测试，三分之一留样，三分之一必要时复测用。样品最小包装不应有破裂，检验前不得启开。

　　在100级净化条件下或超净工作台中用无菌方法至少打开5个小包装，从中随机准确称取10 g样品，剪碎后加入到100 mL灭菌生理盐水中，振打80次或用混匀器充分混匀。每一种样品共取30 g，分别接种3管生理盐水样液。

A3.1操作步骤

待上述样液自然沉降后取上清液作菌落计数。共接种6个平皿，每个平皿中加入1 mL样液，然后用冷却至45℃左右的熔化的营养琼脂15 mL倒入平皿内，混合均匀。待琼脂凝固后翻转平皿置37℃ 培养24 h后，计算平板上的菌落数。当平板上菌落数超过300时应稀释后再计数。

A3.2 菌落计数及结果报告

菌落呈片状生长的平板不宜采用；计数符合要求的平板上的菌落，按式(A1)计算结果：

　　每克样品细菌菌落总数(cfu/g)＝平板上菌落平均数×10 (A1)

　　所得结果超过标准值的10％，必须重复检测一次，以两次结果的平均数为最终结果。

　　当菌落数在100以内时，按实有数报告，大于100时采用二位有效数字。

A4.1 操作步骤

取样液的上清液接种乳糖胆盐发酵管。共接种3管，每管接种1 mL样液，置37℃ 培养24 h，如不产酸也不产气，则报告为大肠菌群阴性。

　　如产酸产气，则划线接种伊红美蓝琼脂平板，置37℃ 培养18～24 h，观察平板上菌落形态。典型的大肠菌落为黑紫色或红紫色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽，也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落。

　　挑取可疑大肠菌落1～2个进行革兰氏染色镜检，同时接种乳糖发酵管于37℃培养24 h，观察产气情况。

A4.2 结果报告

凡乳糖胆盐发酵管产酸产气，乳糖发酵管产气，在伊红美蓝平板上有典型大肠菌落，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，可报告被检样品检出大肠菌群。

A5.1 操作步骤

取样液5 mL，加入到50 mL SCDLP培养液中，充分混匀，置37℃培养24 h。

　　自上述增菌液中取1～2接种环，划线接种在血琼脂培养基上，置37℃培养24～48 h。在血琼脂平板上该菌菌落呈金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。

　　挑取典型菌落，涂片作革兰氏染色镜检。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列成葡萄状，无芽胞与荚膜。镜检符合上述情况，应进行下列试验：

　　甘露醇发酵试验：取上述菌落接种到甘露醇培养液中，置37℃培养24 h，发酵甘露醇产酸者为阳性。

　　血浆凝固酶试验

玻片法：取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴生理盐水，另一端滴加一滴兔血浆，挑取菌落分别与生理盐水和血浆混合，5 min如血浆内出现团块或颗粒状凝块，而盐水滴仍呈均匀混浊无凝固则为阳性，如两者均无凝固则为阴性。凡盐水滴与血浆滴均有凝固现象，再进行试管凝固酶试验。

试管法：吸取1∶4新鲜血浆0.5 mL，放灭菌小试管中，加入等量待检菌24 h肉汤培养物0.5 mL。混匀，放37℃温箱或水浴中，每半小时观察一次，24 h之内呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物各0.5 mL作阳性与阴性对照。

A5.2 结果报告：凡在琼脂平板上有可疑菌落生长，镜检为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。

A6.1 操作步骤

取样液5 mL加入到50 mL匹克氏肉汤（A1.9）中，37℃培养24 h。

　　将培养物划线接种血琼脂平板，37℃培养24 h观察菌落特征。溶血性链球菌在血平板上为灰白色，半透明或不透明，针尖状突起，表面光滑，边缘整齐，周围有无色透明溶血圈。

　　挑取典型菌落作涂片革兰氏染色镜检，应为革兰氏阳性，呈链球状排列的球菌。镜检符合上述情况，应进行下列试验：

链激酶试验：吸取草酸钾血浆0.2 mL(0.01 g草酸钾加5 mL兔血浆混匀，经离心沉淀，吸取上清液)，加入0.8 mL灭菌生理盐水，混匀后再加入待检菌24 h肉汤培养物0.5 mL和0.25％氯化钙0.25 mL，混匀，放37℃水浴中，2 min观察一次(一般10 min内可凝固)，待血浆凝固后继续观察并记录溶化时间。如2 h内不溶化，继续放置24 h后观察，如凝块全部溶化为阳性，24 h仍不溶化为阴性。

　　杆菌肽敏感试验：将被检菌菌液涂于血平板上，用灭菌镊子取每片含0.04单位杆菌肽的纸片放在平板表面上，同时以已知阳性菌株作对照，在37℃下放置18～24 h，有抑菌带者为阳性。

A6.2 结果报告：镜检革兰氏阳性链状排列球菌，血平板上呈现溶血圈，链激酶和杆菌肽试验阳性，可报告被检样品检出溶血性链球菌。