致病性大肠埃希氏菌及其检验（3）

五、检验

致病性大肠埃希氏菌的检验应按《中华人民共和国国家标准——食品卫生检验方法(微生物学部分)》(GB489．6-84)的有关内容进行检验。

（一）、增菌培养

1、以无菌操作的方法称取样品25g，加入225ml营养肉汤培养基中，可用灭菌砂在研钵中磨碎或以均质器打碎样品。

2、取适量接种于乳糖胆盐培养基中，测定大肠菌群MPN，其余移入500ml三角瓶中于36±1℃培养6小时。挑取一环，接种于一管30ml肠道菌增菌汤中，42℃增菌培养18小时。

（二）、分离培养

1、将乳糖胆盐发酵阳性管液与增菌液分别划线接种于麦康凯或伊红美兰琼脂平板上。

2、于36±1℃培养18—24小时观察菌落

对于污染严重的食品可直接按划线法接种，不经过增菌过程。

（三）、生化试验

1、初筛试验

选取在麦康凯或伊红美兰平板上发酵乳糖或不发酵乳糖的菌落5个以上，分别接种于克氏双糖铁、pH7.2尿素和阿拉伯糖中．经36C培养18～24小时，弃去H2S阳性或尿素酶阳性或阿拉伯糖阴性的培养物。

2、复筛试验

把筛留下的培养物分别接种于缓冲葡萄糖蛋白胨和KCN培养基中，经36+1℃培养48小时，观察生长结果并做V-P试验，弃去V-P阳性及KCN阳性的培养物。

3、证实试验

致病性大肠埃希氏菌属除氧化酶阴性，革兰氏阴性的特征以外，还有以下特性：葡萄糖产酸+，葡萄糖产气+／一，乳糖产酸+90％，柠檬酸盐—，尿素酶一，KCN-，V-P-，动力+或—，阿拉伯糖十，靛基质十95％：可按这些主化特性进一步证实其是否为致病性大肠埃希氏菌属。

（四）血清学试验

1、致病性大肠埃希氏菌血清学试验

假定试验：

从平板上选菌落生长稠密处挑取培养物，用致病性大肠埃希氏菌三种OK多价血清做玻片凝集试验。不凝集的培养物可做阴性报告。

证实试验：

2、侵袭性大肠埃希氏菌血清学试验

在平板上菌落生长稠密处挑取培养物，用侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清做玻片凝集试验，侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清包括两种：OK多价血清和9种OK单价血清：

（五）、产肠毒素大肠埃希氏菌毒素试验

1、动物试验

将经过生化证实试验的大肠埃希氏菌培养物接种肉汤管，于36+1℃培养24小时，3000转／分离心30分钟。取上清液用G6滤器过滤后分作两份，一份加热60℃30分钟，供ST测定用，另一份不加热，供LT测定用。

1）家免结轧回肠段试验：

取体重为2kg的家兔，禁食使肠内容物排空。麻醉后剖腹，取出回肠段，按10～15cm为一段，分段结扎，取一段注射肉汤2mL作为阴性对照，另一段注射已知产毒菌肉汤培养物的上清液2ml作为阳性对照。其他各段分别注射待试菌株肉汤培养物的滤液2mL。将腹壁缝合。

测定LT时，于注射后18小时剖腹检查

测定ST时，于注射后6—8小时剖腹检查

取出肠管分别抽取肠段的积液，测定其容量，并测定肠段的长度。积液量(mL)与肠段长度(cm)之比大于l者为阳性。

2）乳鼠灌胃试验：

2、双向琼脂扩散试验

将被检菌按5点环形接种于Elek氏培养基上，以同样操作共做两份，36±1℃培养48小时，在每株菌的菌苔上各放一片多粘菌素纸片，36+1℃经5—6时，使抗生素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5mm处的中央，挖一个直径4mm的园并用一滴琼脂垫底。在一份平板的孔内滴加LT抗毒素30ul，另一份平板的孔内滴加ST毒素30ul。放于36+1℃经15～20小时观察结果，在菌斑和抗毒素之间出现白色沉淀带为阳性，无沉淀带者为阴性。

（六）豚鼠角膜试验

供测定侵袭性大肠埃希氏菌用，将经过生化证实试验的待试菌株18—20小时琼脂培养物，用肉汤洗下，使成每lml含菌9亿个菌悬液，作为接种材料。

体重400--500g的健康豚鼠(角膜与结膜外观正常，并经细菌培养检查)的角膜上接种待试菌悬液1滴。

48小时后观察结果，结膜充血浮肿、角膜混浊、眼内充盈泪液或浆液性分物者为阳性，自结膜囊取样分离细菌，鉴定应与原接种菌一致。

（七）、结果报告

根据以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验和豚鼠角膜试验的结果出报告，如果是产毒大肠埃希氏菌时应有肠毒素试验的结果；如果是侵袭性大肠埃希氏荫应有豚鼠角膜试验和血清学试验的结果；如果是肠致病性大肠埃希氏菌时应有血清学试验结果。

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