嗜水气单胞菌分离株的鉴定与菌株肠毒素及致病性研究

【摘要】  　　目的对嗜水气单胞菌进行鉴定并进行肠毒素检测与致病性分析。方法 采用常规法分离培养，电子显微镜观察形态,用法国梅里埃VITEK32全自动微生物鉴定仪进行系统鉴定。乳鼠灌胃法测定热稳定性肠毒素(ST),小白鼠腹腔注射法测定其毒力。结果检出的嗜水气单胞菌均产热稳定性肠毒素(ST),具备较强的致病性。结论 分离的嗜水气单胞菌具有较强毒力,与致病性密切相关。

【关键词】  腹泻；嗜水气单胞菌；毒力；热稳定性肠毒素

　　Identification of clinically isolated Aeromonas hydrphila and investigation of pathogenicity of its interoxin detected.

　　LI Gang-shan, FAN Quqn-shui, XU Qing, et al.

　　Institute for Medical Reseach of Chengdu Garrion Center for Disease Control and Prevention, Kunming 650032, Yunnan, P. R.China

   

　　Abstract：Objective  To identify the isloates of Aeromonas hydrophila clinically isolated and investigate the phathogenicity of its enterotoxin.  Methods  The isolates were cultured and observed under electron microscope and systemically identified with automatic bioassay device. The pathogenicity of enterotoxin was investigated by peritoneally injecting the enterotoxin into mouse.  Results  The Aeromonas hydrophila producing thermostatic enterotoxin is highly pathogenic.  Conclusion  Aeromonas hydrophila is associated with diarrhea.

    Key words：Diarrhea; Aeromonas hydrophila; Interoxixity; Thermostatic enterotoxin

    嗜水气单胞菌(Aeromonas  hydrophila,以下简称Ah)广泛分布于污水、池水及河底土壤中,为革兰阴性杆菌,是引起腹泻的新病原菌。关于此菌的感染, 国外有较多报道, 而国内仅见有零星报道。近年来,我们对云南边防部队感染性腹泻进行病原监测,采集腹泻患者粪便标本328份,在分离多种肠道病原菌的同时,从中分离出5株Ah,该菌经镜检、培养、法国梅里埃VITEK32微生物全自动分析仪系统鉴定及电子显微镜下观察予以证实,并对菌株进行了肠毒素及致病性研究，报道如下。

　　1.1 菌株来源 

　　从云南边防部队感染性腹泻患者粪便标本中分离。

　　1.2 分离培养 

　　将腹泻患者粪便标本接种于SS琼脂平板上置37℃孵箱培养18～24h，挑取可疑菌落进行纯培养。

　　1.3 生化鉴定 

　　采用常规法和法国梅里埃VITEK32全自动微生物分析仪NFC卡进行系统鉴定。

　　1.4 电子显微镜检查 

　　将分离菌接种普通肉汤培养基,37℃培养18h, 2%磷钨酸(PH6.4)负染制样,用日立－2型电镜检查。

　　1.5 侵袭性测定 

　　采用豚鼠角膜试验（Sereny  test）。

　　1.6 肠毒素测定 

　　采用乳鼠灌胃法测定热稳定性肠毒素(ST)。

　　1.7 致病力测定 

　　15～18g健康小白鼠（购自昆明医学院实验动物中心）雌雄兼用，随机分成试验组和对照组，每组5只，试验组注射Ah肉汤培养物，每只0.5ml,观察小白鼠发病情况，对照组同法注射无菌肉汤，观察7d。

　　1．8 药敏试验 

　　采用K-B纸片扩散法。药敏纸片系北京天坛生物技术开发公司产品，在有效期内使用。

　　2.1 生物学特性 

　　在SS琼脂平板上经37℃培养24h,其菌落形态为圆形，半透明、边缘整齐、光滑、湿润、微隆、直径1～2mm。菌体形态为革兰阴性杆菌，两端钝圆呈单或呈双排列。在暗视野下观察运动极为活泼，在电子显微镜下可见极端鞭毛（见图1）。

　　2.2 系统生化鉴定

　　VITEK32全自动微生物分析仪NFC卡系统鉴定结果见表1。表1  分离的嗜水气单胞菌生化特征试验项目结果 （略）

　　2.3 侵袭力测定 

　　豚鼠角膜试验阴性。

　　2.4 肠毒素测定 

　　经乳鼠灌胃试验测试，分离的5株Ah肠/体之比均大于0.083,分别是0.091、0.105、0.087、0.123、0.096。证明产生较强的热稳定性肠毒素（ST）。

　　2.5  致病力测定 

　　5株分离菌肉汤培养物分别腹腔注射小白鼠后，均在24h左右发病，表现为弓背、耸毛、运动迟缓、食欲不振，双眼半闭、呼吸急促等症状，72h内相继死亡。解剖死亡的小白鼠，发现肠水肿，肠腔积液等，取肠内容物培养，仍获原感染菌。注射无菌肉汤的对照组观察7d无不良反应。

　　2.6 药敏试验 

　　在所试的12种抗菌药物中 ，对9种敏感，1种中度敏感，3种耐药，见表2。表2  分离的嗜水气单胞菌药敏试验结果抗菌素纸片含量（略）注：S: 敏感； MS: 中度敏感； R：耐药。

　　3.1 Ah是气单胞菌属中的细菌之一，该菌广泛存在于水环境中，是一种人—畜—水生动物共患病病原菌。此类菌致病性决定于某些菌株的侵袭力、热稳定性肠毒素和不稳定性肠毒素，该毒素和溶血素为气单胞菌类主要致病因子［1］。该分离菌侵袭力测定为阴性，产热稳定性肠毒素（ST），致病性测定有较强的致病力，与临床症状密切相关。我们从边防部队腹泻病人粪便标本中分离出5株Ah，患者的主要临床表现是：类似急性胃肠炎，症见腹泻、呕吐、腹痛，无发热。Ah不仅感染动物，而且也是引起人类腹泻的新病原菌。由于条件所限，未做不稳定肠毒素和溶血素测试。目前，国外已将Ah纳入腹泻病原菌的检测范围［2］。

　　3.2 气单胞菌属的细菌通常不产生赖氨酸脱羧酶，但与致病性有关的气单胞菌赖氨酸脱羧酶阳性率较高，如本次分离的5株Ah赖氨酸脱羧酶均为阳性。对Ah的研究，国内很少有人用电子显微镜观察其菌体形态，我们使用了较先进的电镜对分离的Ah进行观察，有助于对菌体结构的认识。使用先进的VITEK32全自动微生物分析仪对其菌株进行鉴定，具有快速、省事、省力且结果准确等优点。由于Ah的生化特性与肠干菌科、弧菌属、邻单胞菌属较为相似，没有先进设备的基层单位，可利用氧化酶试验、粘丝试验、鸟氨酸脱羧酶和甘露醇、肌醇发酵等反应来鉴别。腹泻病原感染因子的研究在临床治疗上具有重要意义，不同细菌的感染因子所需的首选药物不尽相同，我们做的药敏试验，筛选出敏感、中度敏感、耐药三类药敏谱，对指导部队和地方今后治疗Ah的感染具有重要的指导意义。

 

作者：李刚山，范泉水，徐庆，周卫国，李作生，张富强，邱薇，张琳，王承珠，袁贵红    《中国热带医学》

 

［1］王秀茹. 预防医学微生物及检验技术［M］.第1版.北京：人民卫生出版社，2002,353.

 

［2］杨守明. 嗜水气单胞菌及其对人的致病性［J］.疾病控制杂志，2006,10（5）：511～514.