小肠结肠炎耶尔森氏菌检验(2)

 

结果分析判定及注意事项

 

（一）一般培养性状

本菌为革兰氏阴性杆菌或球杆菌，普通碱性染料易于着色，偶而可见两极浓染，大小为0.8~3.0μm×0.8μm，多为单个散在，有时排列为短链状或成堆，不形成芽胞，无荚膜，有周鞭毛，但不稳定，于26℃培养物中可见周鞭毛，30℃以上易消失，26℃培养有动力，37℃培养无动力，在22~26℃普通培养基上生长的幼龄菌，球形占优势，37℃培养时或在陈旧培养物中趋向多形性。最适温度为22~29℃，能在0~4℃生长繁殖，在肠道细菌所用的培养基上都能生长，但生长速度比一般肠道细菌慢，如在SS琼脂和麦康凯琼脂培养基上24h培养后菌落极小，48h可生成圆形、光滑、湿润、扁平、半透明的菌落，初分离的菌落多为光滑型，连续培养或保存不适，可有粗糙型出现。在去氧胆酸钠琼脂上，菌体个体差异显著，主要呈明显大小不一，球杆、杆状并存，有时可见有着色不良的个体，在CIN琼脂上生长良好，菌落较大，直径可达1.5~3.5mm，菌落中心呈红色，周围有明显透明环的特点，易于观察区别。不同型的菌株，菌落大小有明显不同。在肉汤等液体培养基中生长均匀混浊，一般不形成菌膜。

图7-1　小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序

 

（二）样品采取和处理

采取的样品以无菌操作放灭菌容器内，应立即送检，并注意冷藏，根据样品的种类分别进行处理，固体食品如肉类及其制品等，均需用均质器打碎或用乳钵研磨后再进行增菌培养。

 

（三）增菌培养

为使受损伤的小肠结肠炎耶尔森氏菌得到较好的恢复和繁殖或由污染少量细菌的样品中检出，必须采用增菌的方法，根据该菌能在0~4℃生长的特点，采用4℃冷增菌，有利于耶氏菌存活和缓慢繁殖，而对大多数其他细菌不利或保持不变，特别适用于含菌量少的被检材料，同时改良磷酸盐缓冲液对本菌有一定的选择性，经冷增菌培养后，分别在7d、14d、21d时进行分离，可获得较好的检出效果，虽然增菌时间较长，但可提高检出率。

 

（四）碱处理

小肠结肠炎耶尔森氏菌比其他革兰氏阴性细菌生长慢，因其他细菌都能在弱选择性分离琼脂平板上生长，尤其在22~26℃情况下仍可生长较快，而耶尔森氏菌往往易被掩盖。为控制其他细菌的过多生长，采用耶尔森氏菌对弱碱性有较高低抗力的特点，将冷增菌后的样液，经弱碱液迅速处理15s，立即接种选择性平板进行分离，此方法可杀死大部分不耐碱的其他细菌，可提高小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出率。必须严格掌握处理方法，不宜超过时间，以免影响检出效果。

检验乳品时不需要进行碱处理，增菌培养后可直接进行分离，尤其在细菌污染较少情况下的样品，经碱处理后有时对该菌的检出也能受到影响。

 

（五）分离培养

将上述冷增菌液和碱处理后的培养物分别分离CIN-1平板和改良y培养基，经26℃ 48h培养后观察，挑选可疑菌落，小肠结肠炎耶尔森氏菌在CIN-I平板上生长菌落较大，扁平，有明显的边缘，中心为深红色，周围有半透明圆环的特征，成牛眼状菌落，其他肠杆菌在此培养基上与本菌菌落形态不同，易于鉴别。在改良y琼脂平板上生长为无色透明、光滑、扁平、不粘稠的菌落。经样品分离效果比较，改良y的分离率高于麦康凯和SS培养基，因此选用了CIN-I和改良y培养基结合使用，可以达到较好的分离选择效果。

CIN琼脂（Cefsulondin-Irgasan-Novobiocin　Agar）是一种对耶氏菌选择性较强的培养基，为Schienann氏于1979年研制成功的，由于配方中Irgasan成分在我国不易购到，无法应用，经试验后改用二苯醚代替，其选择培养基的效果反应相同，因此称为“CIN-I”。

 

（六）改良克氏双糖试验

由上述平板上挑选可疑菌落，接种改良克氏双糖斜面进行初筛，26℃ 24h后斜面底层均变黄色（少数因不发酵或迟缓发酵蔗糖者斜面可仍为红色），硫化氢阴性和不产生气体的培养物做进一步生化试验。

利用改良克氏双糖琼脂斜面对本菌初筛，比三糖铁琼脂斜面更为可靠。因为有些细菌如变形杆菌、柠檬酸杆菌、克雷伯氏菌等，都可能产生类似耶氏菌的底层和斜面均产酸的反应，在三糖铁琼脂上有15％的细菌反应不一致，难以区分，但在改良克氏双糖上的反应与其他易于混淆的细菌反应不同，绝大部分的耶氏菌在改良克氏双糖斜面上反应一致，耶氏菌甘露醇阳性者为100％，蔗糖阳性者为98％，乳糖则为8％-15％，而变形菌对甘露醇，乳糖则为阴性，即可排除部分非耶氏菌的干扰。

 

（七）尿素酶和动力试验

在进行进一步筛选试验中，尿素酶反应是一项非常重要的生化试验，注意培养基制做时尿素不要高温加热，以防水解影响效果，接种细菌时菌量可适当大些，一般在2~4h培养基变红，为尿素酶阳性。

同时将此菌接种两管半固体，分别放37℃和26℃，24h后观察，小肠结肠炎耶尔森氏菌于26℃培养有动力，在37℃培养不产生动力。

 

（八）生化学性状

小肠结肠炎耶尔森氏菌的生化学特性较为复杂，与肠杆菌科中其他细菌相比，有许多相似之处，但由于耶氏菌的各种生物型别和血清型别的生理学特性不太相同，其某些生化学性状有时是不定的，特别是各种因素的影响，如培养条件、时间、温度的不同，能使某些细菌生化性状改变，有些细菌对醇类的反应迅速，有的迟缓或不发酵。对其地理分布，菌株来源等也有着一定关系，一般生化反应在22~30℃情况下较为稳定。

 

因此，必须掌握好试验要求，以免影响对结果的判定。

其生化学试验项目的选定，各个国家很不一致。本方法采用以下几项主要生化学项目，是由于增菌和初筛试验中，基本上排除了非耶氏菌属的可疑细菌，简化为属内鉴别的分型表（表7-1）。

表7-1　小肠结肠炎耶尔森氏菌与其他相似菌的生化性状鉴别

	小肠结肠炎耶尔森氏菌	中间型耶尔森氏菌	弗氏耶尔森氏菌	克氏耶尔森氏菌	假结核耶尔森氏菌	鼠疫耶尔森氏菌
动力(26℃)	＋	＋	＋	＋	＋	－
尿素酶	＋	＋	＋	＋	＋	－
v-p试验(26℃)	＋	＋	＋	－	－	－
鸟氨酸脱羧酶	＋	＋	＋	＋	－	－
蔗糖	d	＋	＋	－	－	－
棉子糖	－	＋	－	－	－	d
山梨醇	＋	＋	＋	＋	－	－
甘露醇	＋	＋	＋	＋	＋	＋
鼠李糖	－	＋	＋	－	－	＋

 

注：＋阳性；－阴性；d有不同生化型。

 

（九）血清学

小肠结肠炎耶尔森氏菌的抗原结构较为复杂，目前尚未研究清楚，其血清型主要靠菌体抗原即O抗原，至1984年Wauter等增加为57个型，现已知有84个O抗原因子和19个Ｈ抗原因子，在同一血清型的菌株中，可含两种或更多的O抗原，用病人分离的小肠结肠炎耶尔森氏菌，其血清型大部分为O：3，O：5，O：8和O：9型，某些O抗原同其他细菌有共同性，如O：9与布氏菌有交叉反应，O：12血清与沙门氏菌有交叉反应等，在流行病学调查中，血清学诊断起着较为重要的作用，但在区分致病性与非致病性上价值不大。

 

进行血清学试验时，可将被检菌接种于普通斜面上，于26℃培养48h，取其培养物用分型血清做玻片凝集试验，注意同时与生理盐水作对照，在三糖铁斜面上于37℃培养的细菌常为粗糙型（R型），容易产生自凝。