厌氧菌的分离与鉴定

 

表5．22．4厌氧菌直接镜检初步鉴别

 

 

 

 

　　根据形态和染色性，结合标本性状与气味，初步对标本中可能有的细菌作出估计。

 

 

　　主要分初代培养和次代培养两个阶段，其中初代培养相对比较困难，关键的问题就是厌氧环境和培养基的选择。初代培养的一般原则是：

 

　　a．先将标本涂片染色直接镜检，指导培养基的选择。

 

　　b．尽量选用在厌氧菌中覆盖面宽的非选择性培养基。

 

　　c．最好多选1~2种覆盖面不同的选择性培养基。

 

　　d．尽量保证培养基新鲜。

 

　　e．要考虑到微需氧菌存在的可能。

 

　　1．选用适当的培养基接种，应接种固体和液体两种培养基。

 

　　(1)培养基的使用：应注意下列各点：

 

　　1)尽量使用新鲜培养基，2～4h内用完；

 

　　2)应使用预还原培养基，预还原24～48h更好；

 

　　3)可采用预还原灭菌法制作的培养基(用前于培养基中加入还原剂，如L-半胱氨酸、硫乙醇酸钠、维生素C及葡萄糖等，尽可能使预还原剂处于还原状态)；

 

　　4)液体培养基应煮沸l0min，以驱除溶解氧，并迅速冷却，立即接种；

 

　　5)培养厌氧菌的培养基均应营养丰富，并加有还原剂与生长刺激因子(血清、维生素K、氯化血红素、聚山梨酯-80等)。

 

　　(2)培养基的选择：初次培养一般都使用选择培养基和非选择培养基。

 

　　1)非选择培养基：本培养基使分离的厌氧菌不被抑制，几乎能培养出所有的厌氧菌。常使用心脑浸液琼脂(BHI)、布氏琼脂(BR)、胰豆胨肝粉琼脂(GAM)、胰胨酵母琼脂(EG)、CDC厌氧血琼脂等。

 

　　2)选择培养基：为有目的的选择常见厌氧菌株，以便尽快确定厌氧的种类。常用的有KVLB血平板(上述非选择培养基中加卡那霉素和万古霉素)、KVLB冻溶血平板(置～20℃，5～10min，以利产黑素类杆菌早期产生黑色素)、七叶苷胆汁平板(BBE，用于脆弱类杆菌)、FS培养基(梭杆菌选择培养基)、ES培养基(优杆菌选择培养基)、BS培养基(双歧杆菌选择培养基)、卵黄(EYA)及兔血平板(RBA)(用于产气荚膜梭菌)、VS培养基(用于韦荣球菌)、CCFA培养基(艰难梭菌选择培养基)等。

 

　　2．每份标本至少接种3个血平板，分别置于有氧，无氧及5％～l0％C0₂环境中培养，以便正确地培养出病原菌，从而判断其为需氧菌、兼性厌氧菌、微需氧菌或厌氧菌中的哪一类。

 

　　3．厌氧培养法

 

　　(1)厌氧罐培养法：在严密封闭的罐子内，应用物理或化学的方法造成无氧环境进行厌氧培养。常用冷触媒法、抽气换气法，钢末法和黄磷燃烧法。

 

　　(2)气袋法：利用气体发生器产生二氧化碳和氢气，后者在触媒的作用下与罐内的氧气结合成水，从而造成无氧环境。

 

　　(3)气体喷射法：又称转管法。本法系从培养基的制备到标本的接种直至进行培养的全过程，均在二氧化碳的不断喷射下进行。本法的关键是有无氧和C02。

 

　　(4)厌氧手套箱培养法：是迄今厌氧菌培养的最佳仪器之一，该箱由手套操作箱与传递箱两部分组成，前者还附有恒温培养箱，通过厌氧手套箱可进行标本接种、培养和鉴定等全过程。

 

　　(5)其他培养法：平板焦性没食子酸法；生物耗氧法；高层琼脂培养法。

 

　　4．厌氧状态的指示美蓝和刃天青。无氧时均呈白色，有氧时美蓝呈蓝色，刃天青呈粉红色。

 

　　5．分离培养厌氧菌失败的原因 培养前未直接涂片和染色镜检；标本在空气中放置太久或接种的操作时间过长；未用新鲜配制的培养基；未用选择培养基；培养基未加必要的补充物质；初代培养应用了硫乙醇酸钠；无合适的厌氧罐或厌氧装置漏气；催化剂失活；培养时间不足；厌氧菌的鉴定材料有问题。

 

　　6．鉴定试验可根据厌氧菌的菌体形态、染色反应、菌落性状以及对某些抗生素的敏感性作出初步鉴定。最终鉴定则要进行生化反应及终末代谢产物等项检查。

 

　　(1)形态与染色：可为厌氧菌的鉴定提供参考依据。

 

　　(2)菌落性状：不同的厌氧菌其菌落形态和性质不同。梭菌的菌落特点是形状不规则的，而无芽胞厌氧菌多呈单个的圆形小菌落。色素、溶血特点以及在紫外线下产生荧光的情况也可以作为厌氧菌鉴定的参考依据。

 

　　(3)抗生素敏感性鉴定试验：常用的抗生素有卡那霉素及甲硝唑。卡那霉素可用于梭杆菌属与类杆菌属的区分，甲硝唑用于厌氧菌与非厌氧菌的区分。

 

　　(4)生化特性：主要包括多种糖发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂肪酸酶试验、蛋白溶解试验、明胶液化试验、胆汁肉汤生长试验以及硫化氢试验等。目前有多种商品化的鉴定系统可以使用。

 

　　(5)气液相色谱：可以利用该技术来分析厌氧菌的终末代谢产物，已成为鉴定厌氧菌及其分类的比较可靠的方法。