毛霉的分离和豆腐乳的制备

1 目的

1.1  学习毛霉的分离和纯化方法。 

1.2  掌握豆腐乳发酵的工艺过程。

1.3  观察豆腐乳发酵过程中的变化。

 

2 原理

    豆腐乳是我国独特的传统发酵食品，是用豆腐发酵制成。民间老法生产豆腐乳均为自然发酵，现代酿造厂多采用蛋白酶活性高的鲁氏毛霉或根霉发酵。豆腐坯上接种毛霉，经过培养繁殖，分泌蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶等复杂酶系，在长时间后发酵中与淹坯调料中的酶系、酵母、细菌等协同作用，使腐乳坯蛋白质缓慢水解，生成多种氨基酸，加之由微生物代谢产生的各种有机酸，与醇类作用生成酯，形成细腻、鲜香等豆腐乳特色。

3 材料

3.1菌种

毛霉斜面菌种。

3.2 培养基（料）

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），无.菌水、豆腐坯、红曲米、面曲、甜酒酿、白酒、黄酒、食盐

3.3仪器和器具

培养皿、500mL三角瓶、接种针、小笼格、喷枪、小刀、带盖广口玻瓶、显微镜、恒温培养箱。

4 流程

4.1毛霉的分离

    配制培养基→毛霉分离→观察菌落→显微镜检。

4.2豆腐乳的制备

    悬液制备→接种孢子→培养与晾花→装瓶与压坯→装坛发酵→感官鉴定

5 方法

5.1毛霉的分离

5.1.1配制培养基

    马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。经配制、灭菌后倒平板备用。

5.1.2 毛霉的分离

    从长满毛霉菌丝的豆腐坯上取小块于5mL无菌水中，振摇，制成孢子悬液，用接种环取该孢子悬液在PDA平板表面作划线分离，于20℃培养1～2d，以获取单菌落。

5.1.3 初步鉴定

  5.1.3.1菌落观察

    呈白色棉絮状，菌丝发达。

  5.1.3.2显微镜检

    于载玻片上加1滴石碳酸液，用解剖针从菌落边缘挑取少量菌丝于载玻片上，轻轻将菌丝体分开，加盖玻片，于显微镜下观察孢子囊、梗的着生情况。若无假根和匍匐菌丝、或菌丝不发达，孢囊梗直接由菌丝长出，单生或分枝，则可初步确定为毛霉。

5.2 豆腐乳的制备

5.2.1 悬液制备

5.2.1.1毛霉菌种的扩繁 

    将毛霉菌种接入斜面培养基，于25℃培养2d；将斜面菌种转接到种子培养基中，于同样温度下培养至菌丝和孢子生长旺盛，备用。

52.1.2孢子悬液制备

    于上述三角瓶中加入无菌水200mL，用玻璃棒搅碎菌丝，用无菌双层纱布过滤，滤渣倒还三角瓶，再加200mL无菌水洗涤1次，合并滤于第一次滤液中，装入喷枪贮液瓶中供接种使用。

5.2.2 接种孢子

    用刀将豆腐坯划成4.1cm×4.1cm×1.6cm的块，将笼格经蒸汽消毒、冷却，用孢子悬液喷洒笼格内壁，然后把划块的豆腐坯均一竖放在笼格内，块与块之间间隔2cm。再用喷枪向豆腐块上喷洒孢子悬液，使每块豆腐周身沾上孢子悬液。

5.2.3 培养与晾花

    将放有接种豆腐坯的笼格放入培养箱中，于20℃左右下培养，培养20h后，每隔6h上下层调换一次，以更换新鲜空气，并观察毛霉生长情况。44～48h后，菌丝顶端已长出孢子囊，腐乳坯上毛霉呈棉花絮状，菌丝下垂，白色菌丝已包围住豆腐坯，此时将笼格取出，使热量和水分散失，坯迅速冷却，其目的是增加酶的作用，并使霉味散发，此操作在工艺上称为晾花。

5.2.4 装瓶与压坯

    将冷至20℃以下的坯块上互相依连的菌丝分开，用手指轻轻在每块表面揩涂一遍，使豆腐坯上形成一层皮衣，装入玻璃瓶内，边揩涂边沿瓶壁呈同心圆方式一层一层向内侧放，摆满一层稍用手压平，撒一层食盐，每100块豆腐坯用盐约400g，使平均含盐量约为16%，如此一层层铺满瓶。下层食盐用量少，向上食盐逐层增多，腌制中盐分渗入毛坯，水分析出，为使上下层含盐均匀，腌坯3～4d时需加盐水淹没坯面，称之为压坯。腌坯周期冬季13d，夏季8d。

5.2.5 装坛发酵

5.2.5.1红方

    按每100块坯用红曲米32g、面曲28g、甜酒酿1kg的比例配制染坯红曲卤和装瓶红曲卤。先用200g甜酒酿浸泡红米和面曲2d，研磨细，再加200g甜酒酿调匀即为染坯红曲卤。将腌坯沥干，待坯块稍有收缩后，放在染坯红曲卤内，六面染红，装入经预先消毒的玻瓶中。再将剩余的红曲卤用剩余的600g甜酒酿兑稀，灌入瓶内，淹没腐乳，并加适量面盐和50度白酒，加盖密封，在常温下贮藏6个月成熟。

5.2.5.2白方

    将腌坯沥干，待坯块稍有收缩后，将按甜酒酿0.5kg、黄酒1kg、白酒0.75kg、盐0.25kg的配方配制的汤料注入瓶中，淹没腐乳，加盖密封，在常温下贮藏2～4个月成熟。

5.2.6 质量鉴定

将成熟的腐乳开瓶，进行感官质量鉴定、评价。

6结果

    从腐乳的表面及断面色泽、组织形态（块形、质地）、滋味及气味、有无杂质等方面综合评价腐乳质量。

7 思考

 1腐乳生产主要采用何种微生物？

 2 腐乳生产发酵原理是什么？

 3试分析腌坯时所用食盐含量对腐乳质量有何影响？