实验——Ames法检测诱变剂和致癌剂

1 目的 
1.1 理解Ames法快速检测诱变剂和致癌剂原理。 
1.2 掌握Ames法快速检测诱变剂和致癌剂方法。 
2 原理 
食品安全无论如何怎样强调都不会过分，迅速而准确地检测致癌物质是食品安全问题的重要方面。Ames等人发现90％以上的诱变剂是致癌物质，由此，他们创立了一种快速测定法，即利用是否能引起鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型（hisˉ）菌株的回复突变来判断化学物质是否诱变剂和致癌剂，并能区别突变的类型（置换或移码突变）。 
这组检测菌株含有下列突变：① 组氨酸基因突变（hisˉ），根据选择性培养基上出现his＋的回复突变率可测出诱变剂或致癌物的诱变效率。②脂多糖屏障丢失（rfa），该菌株的细胞壁基因有缺陷，使待测物容易进入细胞内。③紫外线切除修复系统缺失（△uvrB）,同时其附近的硝基还原酶和生物素基因缺失（bioˉ），使致癌物引起的遗传损伤的修复降低到最小的程度。④抗药性标记R，表示某些菌株具有抗氨苄青霉素（ampicillin）的质粒，从而提高了检出的灵敏性。 
常用的几株鼠伤寒沙门氏茵命名为：TAl535、TAl537、TAl538、TA 98、TAl 00、TA 97及TAl02等。这是一系列特异的营养缺陷型沙门氏菌株。检测菌株TA1535含有一个碱基置换突变，能检测引起置换突变的诱变剂。TA1537在重复的G-C碱基对序列中有一个移码突变，能检测引起移码的诱变剂。TA100和TA98就是上述菌株分别加上一个抗药性转移因子pKM101质粒后的菌株（质粒易丢失，故应尽可能减少传代）。 
有的致癌物的诱变性是被哺乳动物肝细胞中的羟化酶系统活化的，而细菌却没有这种酶系统，故加入鼠肝匀浆的酶系统能增加检测的灵敏度。 
鼠伤寒沙门氏菌，对化学致癌物来说，不是决定性的试验。但是，目前各地资料表明，Ames试验阳性和致癌之间有十分明显的相关性。根据Ames本人对300余种化学品进行的微生物诱变试验及动物诱癌实验对比，发现二者之间存在着非常明显的一致性。 
Ames试验的优点是，方法灵敏，检出率高，经试验有90％的化学致癌物经都可获得阳性结果；加之方法比较简便、易行，不需特殊器材，容易推广。缺点是，微生物的DNA修复系统比哺乳动物简单，基因不如哺乳动物多，不能完全代表哺乳动物的实际情况。尽管如此，由于存在着上述的优势，故目前在致突变试验中占重要位置，为首选的试验方法。 
3 材料   
3.1 菌种  
鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的几个测试菌株，其突变标记如下表（略）： 
3.2 培养基   
3.2.1 底层培养基 
葡萄糖20g  柠檬酸2g  K2HPO4-3H2O 3.5g  MgSO4•7H2O 0.2g  琼脂（优质）12g   蒸馏水 1000ml  pH7.0  8磅灭菌15分钟  用量1000ml。 
3.2.2 组氨酸-生物素混合液 
称31mg L-盐酸组氨酸和49mg生物素溶于40ml蒸馏水中，备用。 
3.2.3 上层培养基 
0.5g氯化钠，0.6g优质琼脂，加90ml蒸馏水，加热熔化后定容，然后加入10ml组氨酸-生物素混合液，摇匀后分装小试管80支，每支3ml，8磅灭菌15分钟。用量250ml。 
3.2.4 “素琼脂” 
0.5g氯化钠，0.6g优质琼脂，加90ml蒸馏水，加热熔化后定容。分装小试管25支，每支3ml，8磅灭菌15分钟。用量100ml。 
3.2.5 肉汤培养基 
牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，自来水1000ml。调节pH至7.2～7.4，121℃灭菌20分钟。用量500ml。 
3.2.6 肉汤培养液 
在肉汤培养基未加琼脂前，分装10支试管，每支5ml。 
3.3 肝匀浆S-9 
选成年雄性大白鼠3只（每只体重在300g左右），称重，按每公斤体重腹腔注射诱导物五氯联苯油溶液2.5ml（五氯联苯用玉米油配制，浓度为200mg/ml）提高酶活力。注射后第5天杀鼠，杀前大鼠禁食24h，取3只大白鼠的肝脏合并后称重，用0.15M KCl溶液洗涤3次，剪碎，每克肝脏（湿重）加3ml 0.15M KCl溶液，制成匀浆，离心（9000转/分 10分钟），取上清液（即S-9）分装小试管，每管1～2ml，液氮速冻，-20℃冷藏备用。所用器皿、刀剪、溶液都需保持无菌，并在0～4℃下（也可在冰浴中）操作。 
3.4 大鼠肝匀浆混合液 
制备方法如下： 
3.4.1 0.2M pH7.4磷酸缓冲液 
Na2HPO4•12H2O  7.16g， KH2PO4 2.72g，加水至100ml，灭菌后备用。 
3.4.2 盐溶液 
MgCl2 8.1g，KCl 12.3g，加水至100ml，灭菌后备用。 
3.4.3 NADP（辅酶Ⅱ）和G-6-P（葡萄糖-6-磷酸）使用液 
每100ml使用液含NADP 297mg，G-6-P 152mg，0.2 M pH 7.4的磷酸缓冲液50ml，盐溶液2ml，加水至100ml。细菌过滤器过滤除菌，经无菌试验后分装成每瓶10ml的小瓶，-20℃贮存备用。 
3.4.4 S-9混合液 
取2 ml S-9加入10ml NADP和G-6-P 使用液（将低温贮存S-9 和使用液室温下融化后现配现用），混合液置冰浴中，用后多余部分弃去。 
3.5 试剂 
3.5.1 亚硝基胍（50μg/ml，250μg/ml，500μg/ml，用甲酰胺0.05ml助溶后用pH 6 的0.1 M 磷酸缓冲液配制）；氨苄青霉素（8mg/ml，用0.02 N的NaOH 配制）；黄曲霉毒素B1（50μg/ml，5μg/ml）；结晶紫（1mg/ml）；生理盐水，氯化钾（15M）。 
3.6 器皿 
3.6.1 常用器皿 
培养皿；移液管；试管；15w紫外灯；水浴锅；圆滤纸片（直径10mm的厚滤纸）若干；镊子；黑纸。 
3.6.2 制备肝匀浆的器皿 
注射器5m；台秤；剪刀）；烧杯；匀浆管；高速离心机；血清瓶。 
４流程 
4.1 测试菌株的鉴定 
4.2 NTG和黄曲霉毒素B诱变作用的检测 
细菌培养→纸片点样检测→培养皿掺人检测→加S9检测法→阳性对照和S9活性鉴定 
→诱变性的定性鉴定→诱变性的定量鉴定→数据记录和分析 
５步骤 
５.1 测试菌株的鉴定 
5.1.1 组氨酸和生物素标记的鉴定 
将测试菌株TA1535、TA1537、TA100、TA98、S-CK 等于实验前一天分别挑取一环到5ml肉汤液中，37℃培养过夜，离心洗涤4次。将底层培养基熔化后倒10皿。取10支“素琼脂”熔化后在48℃水浴中保温。分别吸取各试验菌液0.1ml到各试管中，搓匀后立即倾注到底层平板上，每个菌株2皿。用蜡笔划好3个区，在A点上加微量组氨酸固体（加量约芝麻粒的1/2），B点上加微量组氨酸和生物素，C点作空白对照（图7-1），37℃培养2天观察结果。证明除了对照菌株外，其它都是组氨酸和生物素缺陷型。 
5.1.2 脂多糖屏障丢失（rfa）的鉴定 
倒好肉汤培养基平板10皿，取10支“素琼脂”试管按5.1.1的方法倾注带菌的平板，各菌株2皿，在皿中心放一直径为O．6cm的圆形滤纸，滴上10μl结晶紫溶液(1mg／ml)，37℃培养过夜后观察结果，测量抑制圈直径（图7-1）。 
5.1.3 抗药性鉴定 
倒好肉汤培养基平板4皿，在平板中心加0.01ml氨苄青霉素，用接种环轻轻涂成一条带，置37℃待干。用蜡笔划好记号，分别挑取一环试验菌株，按与氨苄青霉素带垂直的方向划线，每皿间隔划三个菌株，每个菌株划两皿，37℃培养过夜，观察结果（图7-1）。 
5.1.4 紫外线切除修复缺失（△uvrB）的鉴定 
倒好肉汤培养基平板4皿，每皿划三条不同试验菌的菌带，每个菌株划两皿（图7-1）。用灭菌的黑纸遮盖培养皿的1/2，置15瓦紫外灯下（距离30cm），照射8秒钟，在暗室内红灯下操作，照好后用黑纸包好，37℃培养过夜，观察结果。 
5.2 NTG的诱变作用 黄曲霉毒素B1的诱变作用 
5.2.1 诱变作用的初检（点滴法） 
5.2.1.1 NTG的诱变作用 
倒好底层培养基平板18皿。融化上层培养基18支放入48℃水浴中保温。将在37℃培养约17h的TA1535，TA100，TA98三个菌株的菌液稀释20倍后，各吸0.2ml菌液入上层培养基试管，搓匀后迅速倾入底层平板上，每个菌株6皿。待凝固后于皿中心放入厚的圆滤纸片，分别加50μg/ml，250μg/ml，500μg/ml的NTG各0.02ml到滤纸片上，即每皿分别是1μg、5μg和10μg，37℃培养两天后观察结果。 
5.2.1.2 黄曲霉毒素B1的诱变作用 
有些诱变剂和致癌剂要经肝匀浆酶系统活化后才能被测出，黄曲霉毒素就是这类物质之一。在测试的前一周事先制备好肝匀浆S-9和含有6-P-G与NADP的pH 7.4 的盐溶液，分别低温保存，实验前将这两部分化冻后按所需量混合制成S-9混合液，本实验取2ml S-9 加入10ml pH 7.4的盐溶液，置冰浴中备用备。 
倒好底层培养基平板24皿，熔化上层培养基24支，放入48℃水浴中保温。将在37℃培养约17小时的TA1535，TA100，TA98三个菌株的菌液稀释20倍后，各吸0.2ml菌液入上层培养基试管，每个菌株8支，其中4株加S-9混合液各0.2ml，另4株不加，搓匀后迅速倾入底层平皿（S-9混合液加入后要立即倾入平皿，以免酶在48℃中失活）。待凝固后在皿中心放一厚的圆滤纸片，取2皿已加S-9混合液和2皿不加者分别加0.02ml的黄曲霉毒素B1（每ml含有50μg黄曲霉毒素B1）。37℃培养两天后观察结果。 
5.2.2 突变频率的测定 
点试法简便，但仅能作为初步的定性测定，只有严格地测定了诱发回复突变频率后才能得到阳性或阴性的肯定结论。 
5.2.2.1 NTG诱发回复突变的频率 
倒好底层培养基平板12皿，熔化上层培养基12支，48℃水浴保温。分别吸取稀释20倍的菌液各0.2ml和NTG（50μg/ml）0.1ml，放入上层试管中，搓匀后立即倾注到底层平板上，每个菌株2皿，每皿含NTG 5μg。另外分别吸取0.2ml菌液入上层试管中，搓匀后立即倾注到底层平板上作对照，每个菌株2皿，37℃培养两天后观察结果，计算自发回复突变率和诱发回复突变率。凡诱发回复率超过自发回复突变率2倍以上者属于阳性，低于2倍者属于阴性。 
为了计算突变频率，必须同时测定各菌液的活菌数目。为此需将上述三菌株的20倍稀释液再稀释至10-5、10-6后各取0.1ml；与肉汤培养基混皿，各菌株4皿，37℃培养两天后计数。 
5.2.2.2黄曲霉毒素B1诱发回复突变的频率 
倒好底层培养基平板24皿，熔化上层培养基24支， 48℃水浴保温。分别吸取稀释20倍的菌液各0.2ml到上层培养基试管，每个菌株8支，其中4株加S-9混合液各0.2ml，另4株不加。分别取2支加S-9混合液和2支不加者到含有5μg/ml的黄曲霉毒素B1各0.2ml（即每皿含有1μg B1），搓匀后立即倾入底层平板上。其余4支不加B1者也搓匀倾入底层平板上。待凝固后置37℃培养两天后计数。 
活菌计数与4.2.2.1相同。 
6 结果 
6.1 记下测试菌株的鉴定结果 
6.1.1 组氨酸和生物素标记的鉴定。 
6.1.2 脂多糖屏障丢失的鉴定。 
6.1.3 抗药性的鉴定。 
6.1.4 紫外线切除修复缺失的鉴定。 
6.2 把NTG和黄曲霉毒素B1诱变作用的初检（点滴法）结果记在下表中 
表7-2  NTG诱发回复突变的初检结果 
表7-3  黄曲霉毒素B1诱发回复突变的初测结果 
6.3 诱发回复突变频率的测定结果 
表7-4  NTG诱发回复突变频率（％） 
表7-5 黄曲霉毒素B1诱发回复突变频率（％） 
菌株    诱发回复突变（加黄曲霉毒素B1）    （自发回复突变（不加B1） 
 7 思考 
7.1 为什么可以用细菌检测致癌物质？ 
7.2 对致癌物质检测为什么选用回复突变基因作标记？ 
8 注意事项 
8.1 鼠伤寒沙门氏菌是条件致病菌，所以用过的器皿应放入石碳酸中或进行煮沸灭菌，培养基也应经煮沸后倒弃。 
8.2 肝匀浆的提取应重视无菌操作，并应做无菌测定，入无低温条件时，提取过程尽可能用冰浴保持低温。S-9混合液要在使用时随时配制。 
8.3 倒底层培养基时，待融化好的培养基冷却到45～50℃时倒皿，尽可能减少平板表面的水膜，防止上层“滑坡”，能预先在37℃过夜则更好。 
8.4 NTG和黄曲霉毒素都是强烈致癌物，操作时要胆大心细，切勿用嘴吸取，用过的器皿要用水大量冲洗或放入0.5M硫代硫酸钠中解毒后方可清洗。 
6 结果  
霍德华霉菌计测数值，又称霉菌数，用百分比表示。其含义如下： 
将0.15mm3标准样液，均匀地摊布成厚0.1mm，直径为1.382mm，其面积为1.5mm2的标准视野，在显微镜下检查。按100个视野数计算，其中发现有霉菌菌丝存在的视野数（即阳性视野数）。 
根据霉菌数含义，其计算公式如下： 
                 
霉菌数（％）＝阳性视野数/50×100％     
                    
举例如图18-6：记录的阳性视野数，片1为15，片2为16，则样品的霉菌数为： 
                   
样品霉菌数（％）＝（15＋16）/50×1/2×100％＝31％ 
实验要注意下述三个问题： 
6.1 番茄酱霉菌数指标 
部颁标准为阳性视野不超过40％，在国际贸易中，合同上无要求时按部颁标准执行，合同上有要求时按合同执行。 
6.2 制片数量 
每抽取一罐样品制两个片子，每片观察50个视野，如果超过标准指标，应该继续制片，但片子数量不得少于3片即150个视野，如果计测结果相近时，可取其平均值。 
6.3 复检数量 
如对抽样结果有异议，，应加倍抽样。全部合格，作为合格处理，其中有一罐不合格，该批作为不合格处理。 
五  报告要求  
    作好计测记录，按记录计算计测结果并作报告

 

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