滤膜法测定总大肠菌群

1 主题内容与适用范围

    本方法规定了生活饮用水中总大肠菌群的滤膜测定方法。

    本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中总大肠菌群数的测定。

    2 方法提要

    用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数。

    3 培养基与试剂

    3.1 品红亚硫酸钠培养基

    3.1.1 成份

    A 蛋白胨 10g

    B 酵母浸膏 5g

    C 牛肉膏 5g

    D 乳糖 10g

    E 琼脂 15~20g

    F 硫酸氢二钾 3.5g

    G 无水亚硫酸钠 5g左右

    H 碱性品红乙醇溶液(50g/L) 20mL

    I 蒸馏水 1000mL

    3.1.2 储存培养基的制备

    先将琼脂加到500mL蒸馏水中，煮沸溶解，于另500mL蒸馏水中加入硫酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，补充蒸馏水至1000mL，混匀后调pH为7.2~7.4，再加入乳糖，分装，115℃高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。

    3.1.3 平皿培养基的配制

    将上法制备的储存培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5％碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水硫酸钠置于另一灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭菌。

    用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储存培养基内，并充分混匀(防止产生气泡)，立即将此种培养基15mL倾入已灭菌的空平皿中。待冷却凝固后置冰箱内备用。此种以制成的培养基于冰箱内保存不宜超过二周。如培养基已由淡粉色变为深红色，则不能再用。

    3.2 乳糖蛋白胨培养基

    3.2.1 成份

    A 蛋白胨 10g

    B 牛肉膏 3g

    C 乳糖 5g

    D 氯化钠 5g

    E 溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL

    F 蒸馏水 1000mL

    3.2.2 制法

    将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2~7.4，再加入1mL1.6％溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，115℃高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用。

    4 仪器

    4.1 滤器。

    4.2 滤膜，孔径0.45~0.65μm。直经根据滤器规格，目前常用的有3.5cm和4.7cm两种。

    4.3 抽滤设备。

    4.4 无齿镊子。

    4.5 培养箱: 36±1℃。

    4.6 冰箱: 0~4℃。

    4.7 天平。

    4.8 显微镜。

    4.9 平皿: 直径为9cm。

    4.10 灭菌刻度吸管: 1mL,10mL。

    5 检验步骤

    5.1 准备工作

    5.1.1 滤膜灭菌:

    将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2~3次，以除去残留溶剂。

    5.1.2 滤器灭菌: 用点燃的酒精棉球，火焰灭菌。也可用121℃高压灭菌20min。

    5.2 过滤水样

    用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，帖放在已灭菌的滤床上、，固定好滤器，将100mL水浴(如水样含菌数较多，可减少过滤水样量，或将水样稀释)注入滤器中，打开滤器阀门，在负0.5大气压下抽滤。

    5.3 培养

    水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基(36.1.3.1)上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入37℃恒温箱内培养22~24h。

    6 观察结果

    6.1 挑出符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检。

    紫红色，具有金属光泽的菌落。

    深红色，不带或略带金属光泽的菌落。

    淡红色，中心色较深的菌落。

    6.1.1凡革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养基液，于37℃培养24h，有产酸产气者，则判定为总大肠菌群阳性。

    6.1.2 计算滤膜上生长的总大肠菌群数，以每100mL

                                                  

    总大肠菌群菌落数(CFU/100mL)＝水样中的总大肠菌群数报告之(CFU/100mL)/ 过滤的水样体积(mL)