阪崎肠杆菌噬菌体的分离及其生物学特性（1）

摘要： 【目的】以阪崎肠杆菌模式菌株及分离菌株为指示菌，从污水中分离出该菌噬菌体，并对其基本生物学特性进行研究。【方法】以双层琼脂法从污水中分离噬菌体，通过同属和同科参考菌株测定噬菌体的特异性和宿主谱；电镜观察噬菌体颗粒形态；随机扩增多态性DNA ( RAPD ) 实验分析噬菌体的分子生物学特性。【结果】从污水中分离得到5株噬菌体，表现出较窄的宿主范围，仅裂解阪崎肠杆菌，以ATCC51329分离的噬菌体SK2可裂婀 17株阪崎肠杆菌中的24株 (89％)，负染经电镜观察，5株噬菌体都是由多面体头部和尾部组成；随机引物( 5^’一GAAACGGGTG一3^’ ) 扩增DNA分析，5株噬菌体DNA明显不同：【结论】分离出的5株噬菌体仅对阪崎肠杆菌敏感，在阪崎肠杆菌的分型、预防、治疗、以及生态环境的净化等方面具有潜在用途。

关键词：阪崎肠杆菌；噬菌体

中图分类号：X172   文献标识码：A   文章编号：0001—6209(2008)10- 1373-05 

 

近年来，阪崎肠杆菌( Enterobacter sakazakii) 通过婴幼儿配方奶粉引起新生儿发病、导致死亡而受到广泛关注…，2002同际食品微生物标准委员会将其定为威胁特殊人群生命或产生严重后遗症的食源性病原菌。该菌1984年前被称为产黄色素的阴沟肠杆菌，之后重新划分为肠杆菌属的一个新种^［2］。目前已从工厂加工环境、食品原料及多种食品中分离出阪崎肠杆菌，为此，各国食品安全管理部门、生产婴幼儿食品的企业对阪崎肠杆菌开始控制，研究人员对其生物学特性、控制方法及溯源性方丽开展研究。作为细菌病毒的噬菌体，以其严格的宿主特异性。应用于细菌的分型鉴定，并逐步在应对多重耐药菌株、医学治疗和预防、食品加工卫生、建立新型畜牧和发酵工厂的消毒程序等方面开发其应用价值，被认为是未来有效、安全的病原体治疗和生态环境净化生物制剂^［5］。

尽管噬菌体的研究历史很长，但对于阪崎肠杆菌噬菌体而言，直到2007年才第一次报道，也是目前查到的仅有的一篇文献^［6］。本文以ATCC标准菌株和分离菌株为指示菌，从污水中分离得到对阪崎肠杆菌具有特异性的噬菌体，并对噬菌体、噬斑形态、宿主范围、分子生物学特性等方面进行了研究。

 

 

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 菌株：阪崎肠杆菌：ATCC29544，ATCC 29004，ATCC 12868，ATCC 51329；阴沟肠杆菌( Enterobactercloacae ) ATCC 13047，产气肠杆菌( Enterobacter aero—gene ) ATCC  13048，大肠埃希氏菌( Escherichia coli ) ATCC 11775。弗氏枸橼酸杆菌( Citrobacter freundii) ATCC 8090，奇异变形杆菌(Proteus mirabilis) ATCC 10005，产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxyto ca ) ATCC 43165， 肺炎克雷伯氏菌( Klebsiella pneumoniae ) ATCC 4352，来自美国典型菌种

保藏中心 ( American TVpe Culture Collection，ATCC 。 其余27株阪崎肠杆菌IQCCl0403、IQCC10403． 1—10403． 26为本实验室收集的从奶粉中分离菌株。ATCC 29544、ATCC

51329、ATCC29004，分离株10403.7和10403-14用于噬菌体的增值。

1．1．2 主要试剂和仪器：脑心浸液肉汤 (BHI)，difc公司；胰酪胨大豆胨琼脂 (TSA)，营养琼脂，北京路桥技术有限公司。M-13DNA纯化试剂盒，美国promega公司产品，随机引物，购自上海博亚生物技术有限公司。扩增设备为GeneAmp PCR 9700PCR(ABI),美国应用生物系统公司出品

     参照文献 ［6］的方法，取北京朝阳市高碑店河水样本，经脱脂棉过滤除去杂质，取100ml,加入1：100稀释的阪崎肠杆菌普通营养肉汤24h培养物6ml，37℃培养3-4h后观察噬菌斑。取双层平板上单个噬菌斑（透明、宽直径）的琼脂块加入5ml营养肉汤中，室温放置1-2h后4℃过夜，次日取其0.1ml加入2ml肉汤培养基中，再加50μL相应宿主菌增菌液，混合后室温放置15min,37℃培养过夜，培养液经无菌滤器（0.22μm微孔滤膜）过滤，将滤液分装4℃保存。滤液适当稀释后，重复以上步骤至少3次，即得到纯化的噬菌体。

1.3   噬菌体滴度测定

     将噬菌体原种用液体培养基作10倍连续稀释后，每稀释度取10μL,加入到0.2ml宿主菌增菌液中，在双层平板测定噬斑滴度，滴度（pfu/mL）=密度适当的平板上的噬斑数×稀释倍数×100^［7］，通过观察形成噬菌斑的情况确定工作滴度（Routine test dilution,RTD）.

1.4 特异性与裂解谱实验

将27株阪崎肠杆菌分离株和其他7种来自ATCC的肠杆菌科细菌参考菌株和分离菌株的工作菌株经BHI增菌后，用无菌鉴沾取培养液涂布于营养琼脂，将10μL滴度为10⁶-10⁹pfu/mL的噬菌体滴在阪崎肠杆菌涂布区域，37℃培养18-24h,通过观察菌苔上是否形成噬菌斑的宿主范围。

1.5  噬菌体的电子显微镜观察

挑去3-4个噬菌斑转到约400μL，SM的缓冲液（5.8g NaCl,2.0g MgSO₄·7H₂O,50mL的1mol/L Tris(pH=7.5),0.1g明胶，于1L去离子水中，100kPa灭菌15min）,样品在室温下放置1h,然后滴到碳质栅网上用乙酸双氧轴进行负燃，使用philips/Tecnai12透射电镜观察和拍照。

1.6        噬菌体分子生物学特性

按照使用说明M-13DNA提取试剂盒提取噬菌体DNA。通过引物5^，-GAAACGGGTG-3^，对提取的噬菌体DNA进行随机扩增多态性（Randomamplified polymorphic DNA,RAPD）实验分析，比较扩增片段的大小，初步得到分离噬菌体的分子生物学特性^［8］.50μL反应液中含25μL 2xPCR混合液（Promega），0.5μmol(2μL)引物，1μL分离DNA作为模板。22μL蒸馏水，循环条件：94℃ 5min,94℃ 1min,37℃ 1min,72℃ 2min，40个循环；72℃ 10min.通过2％琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物。首先检查RAPD-PCR选择的10个碱基长引物，在所有反应中设阴性对照，以确证扩增的可靠性。