阪崎肠杆菌噬菌体的分离及其生物学特性（2）

2   结果

2.1        噬菌体的分离与确证

按照1.6方操作，有5份样品增值物能使阪崎肠杆菌裂解或在其菌苔上产生裂解区域或噬菌斑的物质能够转接或纯化特性说明这些物质不是抗生素或细菌霉素。经随机扩增多态性（RAPD）分析，表明它们为5株不同的噬菌体，分别命名为SKI、SK2、SK3、SK4、和SK5。

5株噬菌体的工作滴度（RTD）和每mL空斑形成单位（PFU/mL）:SKI为10^-4和4.4×10¹⁰；SK2为10^-2和1.58×10⁹；SK3为10^-2和1.78×10⁷；SK4为10^-2和2.12×10⁶。

2.2噬菌体粒子形态

5株噬菌体均由多面体的头部和尾部组成，噬菌体头部较大，尾部粗长，5株噬菌体的整体形态相似，大小略有差异。

2.3噬菌体生物特性

2.3.1  对ATCC参考菌株的易感性：分别测试了5株噬菌体对阪崎肠杆菌ATCC,29544,29004,12868和51329的敏感性。SKI仅仅对其分离菌株ATCC 29544敏感，并表现出较高的滴度。根据ATCC的信息资料，阪崎肠杆菌ATCC 29544也是用于DNA杂交的参考菌株。SK2,对所有4株阪崎肠杆菌参考菌株敏感，并具有较高滴度。值得注意的是，其宿主ATCC 12868最初是作为阴沟肠杆菌被收集保藏的。SK3除对其宿主ATCC 29004敏感外，还对ATCC 29544, 51329表现出裂解活性。噬菌体SK4和SK5的指示菌为奶粉中分离的阪崎肠杆菌，SK4对ATCC参考菌株均不敏感，而SK5对ATCC的参考菌株产生浑浊的噬菌斑（表1）。

2.3.2  宿主范围：为准确评价噬菌体的裂解活动性，在测定宿主范围时，采用纯化后的噬菌体的工作滴度即RTD,除27株阪崎肠杆菌外，还使用了7株肠杆菌科，表2裂解活性。

5株噬菌体SK1，SK2，SK3，SK4，和SK5对非阪崎肠杆菌以外的7株肠杆菌科细菌不敏感。SK1仅能裂解27株分离株中的6株（22％），SK2则能裂解24株（89％），是5株噬菌体中裂解范围最宽的噬菌体，SK5也表现出较宽的裂解范围（74％），但是其形态学特征不同于SK2，对于SK2而言，63％为完全裂解或融合性裂解（confluent lysis,CL），而SK5，63％的裂解模式（opaque lysis,OL）,详见表2。对4株ATCC参考菌株不敏感的噬菌体SK4，表现出较窄的裂解范围，仅能裂解27株实验菌株中的4株，而且，只有1株为CL裂解。

表1  分离的噬菌体在阪崎肠杆菌菌苔上行成的空斑形态及其来源

Table 1  IsolatedE.sakazakii phages:plaque morphology and source

a:Information from ATCC.b:No plaque.

表2 噬菌体宿主范围

Table 2   Host ranges specific to the E.sakazakii

“-”Notsensitive;“CL”confluent lysis;“OL”opaque lysis.

 

讨论

以来源于临床和环境标本、具有代表性的阪崎肠杆菌作为指示菌，从污水中分离出的5 株阪崎肠杆菌噬菌体，SKI、SK2、SK3、SK4和SK5，在生物学特性试验中，表现出清晰的相同的种特异性，但对同种菌株的易感程度却表现出宽窄不同的范围。

分离的阪崎肠杆菌噬菌体通过电子显微镜来观察，所释放噬菌体的头部为20面体，尾部为较粗长尾，根据2005年国际病毒分类委员会第八次报告所提出的分类准则，本研究所分离的5株噬菌体的形态较为符合肌尾噬菌体科(myoviridae) 特征， 5株噬菌的核酸应为d sDNA^［9］。进一步通过DNA分析，显示这些噬菌体具有不同的基因型，不同的特征反映了阪崎肠杆菌的多样性。

肠杆菌科细菌的分类和命名在近年来一直在变化。阪崎肠杆菌最初被认为是产黄色素的阴沟肠杆菌。噬菌体SK4和SK5对阪崎肠杆菌参考菌株不敏感，说明了地方株和参考菌株之间在某些方面存在着差异；仅能裂解其分离宿主ATCC 29544的噬菌体SKI，显示了其特殊性，因为ATCC 29544是用于DNA 杂交的模式菌株；对4株ATCC菌株均易感的噬菌体SK2，对绝大部分分离菌株也表现出较好的裂解性；最初被称为阴沟肠杆菌保存的、现在被更名为阪崎肠杆菌的参考菌株ATCC12868，也仅能被SK2裂解。上述结果提示我们，噬菌体SKI，SK2和SK3可用于阪崎肠杆菌的分类和鉴别。

尽管分离的噬菌体没有一种能够完全裂解27株阪崎肠杆菌，但是按照5株噬菌体的宿主范围，SK2，SK3，SK4和SK5结合使用能够裂解27株试验菌株，在噬菌体被认为是一种消除病原体或减少其危害的有效手段前提下，通过进一步试验，希望能够用于婴幼儿配方粉生产过程及环境中阪崎肠杆菌的控制。

作者：赵贵明，仉庆文，姚李四，陈颖

作者单位：中国检验检疫科学研究院，北京100123

 

参考文献

［1］            Gurtler JB，Komacki JL，Beuchat LR．Enterobacter sakazakii：A coliforln of increa sed concern to infant health．1ntJ Food Micro biology，2005，104：1-34．

［2］            Farmer JJ，As bury MA，Hickman Fw，et a1．Enterobacter sakazakii：a new s pecies of “Enterobacteriaceae” isolated fromclinical specimens．Int J Syst Bac teriol，1980．30：569- 584．

［3］            Kandhai MC，Reij Mw，Gorris LGM，eta1．Occurrence of Enterobacter sakaza kii in food production environments and households．J Lancet，2004, 363：39— 40．

［4］            Iversen C，Forsythe S．Isolation of Enterobacter sakazakii and other  Enterobac teriaceae from powdered infant formula milk and related products．Food Microbi ology．2004，21：77l—777．

［5］            Thiel K．Old dogma，new tricks - -21st century phage therapy．Nat Biotechno1． 2 004，22：31-36 

［6］            Ki m，KP；Klumpp，J；Loessner，MJ．Enterobacter sakazakii bac—teriophag es can prevent bacterial growth in reconstituted infantformula．hlternational Journ al of Food Microbiolog ,2007，1(115 )：195—203．

［7］            徐焰．熊鸿燕，苏明权，等．医院内污水中噬菌体的分离及其生物学特性观察．第四军医大学学报( Journal of Fourth Mili．tary, Medical University)，200 3，24(9)：846—848．

［8］            Lim Mudge KW Weston L A．Utilization of RAPD markers to assess genetic dive rsity of wild populations of North American ginseng( Panax quinquefolium)． Pla nta Med．2007．73：71—76．

［9］            冯书章，刘军，孙洋．细菌的病毒一噬菌体最新分类与命名．中国兽医学报( C hinese Journal of Voterinary Science )，2007年，27 f(4) ：604 - 608．