伴放线放线杆菌形态变化对菌体表面疏水性影响的研究

【摘要】  目的 研究伴放线放线杆菌形态变化对菌体表面疏水性的影响。方法 采用碳氢化合物法检测伴放线放线杆菌粗糙型和光滑型的菌体表面疏水性，观察同一菌株不同表型疏水性的变化。结果 伴放线放线杆菌粗糙型和光滑型菌体表面具有疏水性。14株粗糙型伴放线放线杆菌菌体表面疏水率高于4株光滑型， 差异有统计学意义( P<0．05 )。4株同源的粗糙型与其光滑型转变株比较得出除 1株外，其余3株菌两种表型的菌体表面疏水率差异无统计学意义( P> 0．05 )。结论 伴放线放线杆菌形态变化可引起菌体表面疏水性的改变 ， 粗糙型转变为光滑型后菌体表面疏水性减弱。

【关键词】 伴放线放线杆菌； 疏水性； 形态； 黏附

【中图号】 R780．2 【文献标识码】  A 【文章编号】  1006- 673X( 2008 ) 0l- 0010-03

 

伴放线放线杆菌 ( Actinobacillu actinomycetem-comitans，A．actinomycetemcomitans ) 是牙周可疑致病菌，与侵袭I生牙周炎密切相关。A．actinomycetemcomitans在体外培养过程中可发生粗糙型向光滑型表型的转变，粗糙型与光滑型体外生长方式不同，粗糙型菌株能够紧密黏附到各种固体表面形成生物膜，而光滑型菌株黏附能力明显下降或丧失。液体培养时粗糙型黏附生长，光滑型浮游生长。细菌黏附受很多因素影响，疏水性是重要因素之一。细菌疏水性越高，细菌黏附能力越强^［1］ 。我们应用碳氢化合物法检测A．actinomycetemcomita ns 粗糙型及光滑型菌株表面疏水性的变化，为进一步了解A．actinomycetemcomitans致病的形态学基础提供参考。

1．主要仪器及试剂：722光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂)。正十六烷( 国药集团化学试剂有限公司)；PUM缓冲液( K2HPO ·3H₂O 22．2 g，KH ₂PO₄ 7．26 g，尿素1．8 g，Mg S O 4 · 7H₂O 0．2g， 蒸馏水定容1L，pH 7．1)。

2．实验菌株：伴放线放线杆菌参考菌株ATCC29523、JP2、Y4 (北京口腔医院研究所提供)；14株伴放线放线杆菌临床菌株分离自8例不同牙周状况患者的龈下菌斑；粗糙型菌株均为第2代冻存菌株。   

3．培养：应用伴放线放线杆菌选择培养基或液体培养基，37℃厌氧培养，固体培养3   d、液体2d。

形态及生化鉴定：粗糙型菌株在选择培养基上黏附生长，菌落内部呈星形结构，触酶阳性，乳糖及蔗糖阴性；光滑型菌株除在选择培养基上生长不黏附及内部星形结构消失外其余同粗糙型菌株^［2］。

16S rRNA PCR鉴定：上游引物为5’-AAA CCC ATC TCT GAG TTC TTC TTC-3’；下游引物为 5’- ATG  CCA  ACT  TGA  CGT  TAA  AT-3’；循环参数为95℃预变性2min，94℃变性30s，55 ℃复性1min，72℃延伸2 min，35个循环，72℃延伸10mi n^［3］。 

白细胞毒素启动子PCR鉴定：上游引物为5’-TCC  ATA  TTA  AAT  CTC  CTT   GT-3’， 下游引物为5’- AAC CTG ATA ACA GTA TT-3’；循环参数94℃预变性7min，94℃变性40s，48℃复性40s，72℃延伸3min, 35个循环，72℃ 终延伸9min^［4］.

5 ．细菌的表型转变^［2］：复苏冻存的粗糙型菌株，挑取典型菌落接种TS液体培养基， 37℃厌氧培养，2d传代1次，至液体培养细菌均匀生长。电镜下观察细菌菌毛消失。

6．扫描电镜标本制备：PBS 200μl制备菌悬液，调致OD₅₆₀= 0．15；取10μl菌悬液滴至3 0 0目铜网，干燥，2％乙酸铀酰负染色。  

7． 碳氢化合物法测定疏水性： 各菌固体培养3d收集菌苔。10ml PUM缓冲液洗涤3次，3000r／min离心20rain；以PUM缓冲液为空白对照，用PUM缓冲液调整菌液浓度至660nm波长下OD值为0．5 (OD 660 = 0．5)；取OD660=0．5菌液3mI 加入400  μl十六烷，对照组不加，震荡 60s，静置15 min 分层。 取水相；PUM为空白对照，再测量OD₆₆₀值^［5,6］3次，每次平行做4管。

8．疏水率的计算及统计学处理： 疏水率 =(对照组OD ₆₆₀ -实验组OD ₆₆₀ )×100％／对照组OD ₆₆₀。 采用SPSS11．5统计软件包，独立样本t检验比较不同菌株以及同一菌株表型转变前后疏水性的差异。

 

1．菌株鉴定及菌落形态变化：粗糙型菌株符合其形态及生化特点，PCR检测与标准菌株一致，扫描电镜观察菌体染色深，形态不规则，细胞表面分布大量不同形态菌毛并可见比较多的附着物，相邻菌体可借菌毛相连； 光滑型菌株也符合其形态及生化特点，电镜观察菌体形态规则，染色比粗糙型淡，菌毛消失，表面附着物减少。菌株形态通过液体多次传代，1-2-2，1-2-4，45-1-2,45-2-24株菌从粗糙型转变为光滑型。

2．疏水性测定：光滑型菌株菌体表面疏水率低于粗糙型菌株(表1)，差异有统计学意义 ( P< 0．05 )。同一株菌的菌体表面疏水率粗糙型大于光滑型(表2)，除 1-2-2菌株菌体表面疏水率差异有统计学意义( P<0．05 )，其他3株菌菌体表面疏水率差异无统计学意义( P> 0．05)。

表1 伴放线放线杆菌不同菌落形态

菌体表面疏水率( x±s，％) 

 

表2 伴放线放线杆菌同一株菌不同表型

菌体表面疏水率( x±s，％) 

 

细菌菌体表面疏水性的强弱与表面蛋白、菌毛、脂磷壁酸、荚膜等结构有关^［7,8］证明A．actinomycetemcomitans 从粗糙型转变为光滑型后菌体这些结构成份存在一定变化。应用聚丙烯酰胺凝胶电泳观察粗糙型和同源变异光滑型菌株主要外膜蛋白的差异，发现 18、29、45kDa蛋白带存在于粗糙型菌株，而分子量在31kDa和35kDa左右的2种蛋白与光滑型相关。Haase等^［10］研究发现 RcpA (分子量43kDa )和RcpB(分子量20kDa) 2种蛋白是粗糙型菌株独有的外膜蛋白。F i n e等^［11］对粗糙型和光滑型菌株的菌体表面提取物进行免疫印迹分析， 粗糙型菌株CU1000得出分子量为17 kDa和47kDa的2种特有蛋白，2种表型的脂多糖凝胶电泳类型也存在差别。我们通过连续传代得到4株同源粗糙型转变为光滑型菌株，电镜观察菌毛从存在到消失。

细菌的形态结构与功能是统一的。本研究中A．actinomycetemcomitans菌落从粗糙型转变为光滑型后黏附能力消失。研究报道粗糙型菌株黏附唾液包被的羟基磷灰石能力强，光滑型黏附能力显著降低^［11］。细菌的黏附机制很复杂。疏水作用是细菌非特异性黏附机制的重要组成部分，这种表面特性可能会介导细菌黏附到唾液薄膜上，并与菌斑中其他定植菌发生共聚，从而促进菌斑形成。有关A．actinomycetemcomitans表面是否存在疏水性的研究报道存在相反的结果。Gibbons 等^［12］用十六烷为底物，采用碳氢化合物法得出A．actinomycetemcomitans 是亲水性菌株。而Kozlovsky等用辛烷为底物，碳氢化合物法进行疏水性实验，得出其疏水率在60％～90％之间。Holm等^［13］用对二甲苯为底物，碳氢化合物法测得新分离 A．actinomycetemcomitans疏水率为71％～85％，而实验室菌株的疏水率为52％～60％，差异有统计学意义。本实验采用正十六烷作为检测底物，用碳氢化合物法检测伴放线放线杆菌的菌体表面疏水性，所有实验菌株菌悬液的终OD值与初始OD值相比有明显下降，说明部分菌株与正十六烷结合后从水相上升到油层，菌体表面具有疏水性；粗糙型菌株的疏水率在15％～40％，光滑型菌株的疏水率在12％～33％，与Holm等^［13］纠的研究结果相近。本研究应用菌株包括4株同源粗糙型及光滑型A．actinomycetemcomitans菌株，光滑型疏水率均低于粗糙型菌株。A．actinomycetemcomitans不同菌株之间存在差异。我们在观察A．actinomycetemcomi tans形态变化中也发现，不同菌株之间在传代过程中形态转变的快慢、菌毛的形态及菌毛消失的快慢存在差异。本试验部分菌株应用同一株菌观察表型变化前后细菌疏水性的变化可以排除菌株之间的差异。4株菌株中除1株外，其他3株菌的疏水率差异无统计学意义，提示A．actinomycetemcomitans表型变化虽然引起疏水性的一些变化，但与疏水性的实际关系有待扩大菌株量，进一步研究。

细菌的疏水性虽然不同菌种存在差异，但对一定的菌种应在一定范围之内。伴放线放线杆菌疏水性检测不同实验结果差异比较大可能与实验中所用的菌株、疏水性底物、细菌生长条件等不同有关。Kozlovsky等比较不同培养基、培养时间对疏水性的影响，菌体表面疏水率固体培养低于液体培养， 培养时间延长疏水率降低；另外我们在实验中也发现伴放线放线杆菌光滑型在液体中分散均匀，粗糙型菌株能够产生自凝、沉淀，细菌的分散及分散后的稳定性受到一定影响，也会影响OD值的结果及最后疏水率的记算。

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