乳粉中阪崎肠杆菌的检测方法（2）

阪崎肠杆菌在EMB琼脂平板上呈紫红色粘液状，菌落较大，相邻菌落之间易于融合。 在Mac—conKev脂平板上大小约2～3 mm, 呈淡粉色。在SorbitolMacConKey琼脂平板上 不发酵山梨醇．形成中等大小、圆形突起、边缘整齐的淡黄色菌落。

选择在sorbitolMacConKey琼脂平板上挑取单个菌落接种TSA斜面． 阪崎肠杆菌在 36℃+1℃条件下培养18-24 h．能形成较明显的色素。

2．2．1 形态与染色

革兰氏染色镜检为G- 无芽孢短杆菌．呈球杆状或成对排列．有时亦可呈短链状。

2．2．2  生化特性

菌株触酶阳性、氧化酶阴性、动力阳性、葡萄糖代谢类型 (0／F)为发酵型( F )，IMViC： 靛基质阴性、MR阴性、vP阳性、柠檬酸盐阳性，在TSA斜面上产黄色色素，做进一步进行生化鉴定，结果如表1所示。   

 

本次实验室分离2株阪崎肠杆菌。菌株0819 -041生化反应与标准菌株有不同之处：①卫矛醇阳性。阪崎肠杆菌此项生化反应阳性的仅占0—9％的机率^［4］。②苦可仁甙阴性．此项生化反应是阳性．此项结果阴性目前还未见报道。③明胶酶阳性，明胶酶是胞外蛋白酶的一种．大部分细菌则没有这种能力一般梭状菌、芽孢杆菌、变形杆菌、 假单胞菌具有胞外蛋白酶．使明胶分解而失去凝固力．阪崎肠杆菌明胶酶阳性机率很少。④乳糖为迟缓发酵 (72h )，阴沟肠杆菌会出现乳糖迟缓发酵现象．分析此现象与朱永红报道的阪崎肠杆菌与阴 沟肠杆菌有31％-49％DNA 序列同源^［3］性有关。 菌株0819 - -041经北京药品生物制品检定所依据《伯杰细菌鉴定手册》第9版对其进行鉴定，确认阪崎肠杆菌。

两种修复培养及培养基灵敏度比较结果如表2所示

 

 

表2中，在温 度 为 36℃ ±1℃ 条 件 下 培 养 时 间 均 为 18 ～24  h。 

取2～8℃冰箱保 个月的阪崎肠杆菌斜面直接制备菌悬液。观察修复培养生长情况，试 验结果表明：分别取0．1ml涂布普通营养琼脂平板，经36℃±1℃培养18-24h．未生长阪崎肠杆菌。经修复培养及肠道增菌培养后．A和B两组均能在5种分离培养基上生长，B组比A组修复培养灵敏度高出1个稀释度(10倍)。

2．4 生物学特征及生长情况

阪崎肠杆菌在5种分离培养基上生物学特征及生长情况比较结果如表3所示 

 

 注：+为阳性；-为阴性。

 

用2％NutirentAgar与5种肠道分离培养基比较．Sorbitol Mac ConKey，MacConKey，Xa—GicA培养基上菌落生长数量基本相接近<10％。无统计学差异。Xa—GicA上菌落呈蓝绿色，选择性强，但菌落生长较小。在 MB和VRB—GA琼脂平板上阪崎肠杆菌都呈紫红色黏液 状．由于有融合生长情况．菌落数量有明显差异。

3．1菌株分离要点

选择分离培养基最好选用弱选择性和强选择性培养基各1种或鉴别培养基进行分离养．增 加分离平板种类以及从分离平板上挑选多个可疑菌落进行鉴定。阪崎肠杆菌为肠杆菌科、肠 杆菌属革兰氏阴性无芽孢短杆菌。因此，选择了3种常用的肠道分离培养基．凡是肠杆菌科 的细菌都能在此平板上生长。EMB和MacConKey分别为弱选择性及选择性分离培养基，S or—bitol Mac Con Key可作为鉴别培养基．因为阪崎肠杆菌有不分解山梨醇的特性。挑取菌落要选择在SorbitolMacConKe上淡黄色或无色的菌落，在MacConKey琼脂平板上呈淡粉色。阪崎肠杆菌EMB琼脂平板上呈紫红色黏液状，不易在此平板上挑取单个菌落，只作为 辅助观察。在Sorbitol MacConKey挑取的单个菌落连续接种4支 TSA斜面，便于观察黄色 色素以及分别用于做氧化酶、触酶、生化鉴定及G染色，留1支存放置2～8℃ 冰箱保存。这样保证了所做的生化鉴定与保存的菌种来自于同1个菌落。  

美国疾病预防控制中心2002年从商业配方乳粉中分离到阪崎肠杆菌。当时使用基于Muytjens的方法：100g配方乳粉与400 mL，45℃磷缓冲蛋白胨水(BPW) 混合，36℃培养过 夜^［3］。本文采用这一步骤作为修复培养来提高检测灵敏度。因为乳粉在生产过程中要经过高温喷雾干燥，致病菌易受到亚致死性损伤。比较结果表明：A和B两组对婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌均能起到修复的作用．B组修复培养灵敏度比A组高出1个稀释度(10倍)。阪崎肠杆菌在5种分离培养基上都能生长，其菌落颜色及特征符合该菌的生物学特征性反应。

3．3价格的比较

阪崎肠杆菌分离培养基使用价格的比较结果如表4所示 。     

3．4 出厂检验中的应用比较

荧光PCR试剂盒1900．0元( 48支／盒)：PCR试剂盒1800．0元(48支／盒)。API 20 E为1050．0元 (25支／套)，定性检测，每件样品做1管．分离培养仅挑取1个菌落鉴定计算，结果如表5所示 。

 

 

如果平均每天抽5批次，每批次样品做1管，仅挑取1个菌落鉴定来计算．4 种方法1年所需金额比较结果如表6所示。 

 

注：*为使用Xa-GiaA分离培养基。

    鉴于目前国内外对阪崎肠杆菌检测并无限定标准（标准值≤），国家规定婴儿配方乳粉中是不得检出阪崎肠杆菌。因此本文参照SN/T1632.1-2005中标准进行定性检测。传统微生 物培养具有鉴定结果可靠的特点．能将阪崎肠杆菌鉴定至种．VRBGA 分离培养基鉴定结 果

需要7～8d．使用XaGiaA 分离培养基鉴定结果需要5～6d。选择EMB．MacConKey，Sorb itolMacConKey这3种常用肠道分离培养基，且检测费用低廉，方法便捷，检测鉴定过程6d， 不需更多的设备．只需1台36℃±1℃恒温培养箱．便于乳品企业对每批次产品进行阪崎肠

杆菌检测．有效降低了企业及检测机构检测阪崎肠杆菌的成本。为执法部门的监管带来更多的便利．有着巨大的社会效益和经济效益。

PCR方法及荧光PCR方法可以快速有效地检测目的基因，快速筛选。但是筛选阳性还必须经传统微生物培养、生化鉴定，且检测成本很高．企业检验人员操作有一定的难度。PCR和荧光PCR方法在分子生物学上特异性高．能在种的水平上进一步鉴别菌株间同种不同型的差异，对阪崎肠杆菌各分离株之间进行DNA序列同源性比较．有更大的意义。

作者：高建新，卢兆芸， 肖菊珍， 吴越

作者单位：南 昌 市 疾 病 预 防 控 制 中 心

 

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