微生物常规鉴定技术

微生物常规鉴定技术

一、形态结构和培养特性观察

1、微生物的形态结构观察

微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构(包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。

2、微生物培养特性观察

革兰染色法，丹麦病理学家C.Gram 1884年创立(1)涂片 (2)晾干 (3)固定 (4)结晶紫色染色：1min。水洗 (5)媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。水洗(6) 脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20～25s至流出液无色，立即水洗。　(7) 复染：滴加蕃红复染5min。水洗(8) 晾干：晾干或者用吸水纸吸干。　(9) 镜检：先用低倍，再用高倍，最后用油镜。　(10)实验完毕后的处理：①浸过油的镜头：a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2～3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2～3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。②细菌染色玻片用废擦镜纸将香柏油擦干。

微生物培养特性的观察是微生物检验鉴别中的一项重要内容。

1)细菌的培养特征    包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色(色素是水溶性还是脂溶性)、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况(菌膜、环)混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。

2)霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。

霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。

二、生理生化试验

微生物生化反应：指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。

微生物检验中常用的生化反应有：

糖或醇类发酵试验       淀粉水解试验       V-P试验       甲基红(MR)试验          靛基质(Indole)试验    

过氧化氢酶试验        硝酸盐还原试验     明胶液化试验   尿素酶(Urease)试验         氧化酶试验              

硫化氢(H2S)试验   三糖铁(TSI)琼脂试验    氨基酸脱羧酶的测定    耐盐性试验      卵磷脂酶的测定

石蕊牛奶反应           酪蛋白水解      苯丙氨酸脱氨试验       氰化钾试验            对叠氮化钠的抗性　　　　　

硫化氢-靛基质-动力(SIM)琼脂试验        含碳化合物的利用(柠檬酸盐或丙酸盐利用)

三、血清学试验

血清学反应是指：相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在食品微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。

在细菌的检测中，应用最多的是凝集试验、沉淀反应和补体结合试验。

血清学试验的一般特点：

1)抗原体的结合具有特异性，当有共同抗原体存在时，会出现交叉反应。

2)抗原体的结合是分子表面的结合，这种结合虽相当稳定，但是可逆的。

3)抗原体的结合是按一定比例进行的，只有比例适当时，才能出现可见反应。

4)血清学反应大体分为两个阶段进行，但其间无严格界限。第一阶段为抗原体特异性结合阶段，反应速度很快，只需几秒至几分钟反应即可完毕，但不出现肉眼可见现象。第二阶段为抗原体反应的可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合反应等。反应速度慢，需几分、几十分以至更长时间。而且，在第二阶段反应中，电解质、PH、温度等环境因素的变化，都直接影响血清学反应的结果。

1、凝集反应(Agglutination reaction)

颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应。其中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。在该反应中，因为单位体积抗体量大，做定量实验时，应稀释抗体。

1)直接凝集反应：a. 玻片凝集法； b. 试管凝集法       2)间接凝集反应

2、沉淀反应(Precipitation test)

可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。反应中的抗原称为沉淀原，抗体为沉淀素。由于在单位体积内抗原量大，为了不使抗原过剩，故应稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。

1)环状沉淀反应 2)絮状沉淀反应3)琼脂扩散试验

3、补体结合反应(Complement fixation reaction)

补体结合反应是在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。补体无特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合而引起反应。如果补体与绵羊红细胞、溶血素的复合物结合，就会出现溶血现象; 如果与细菌及相应抗体复合物结合，就会出现溶菌现象。因此，如果出现溶菌，说明抗原抗体是相对应的(试验结果阳性)；如果出现溶血，说明抗原抗体不相对应(阴性)。

此反应操作复杂，敏感性高，特异性强，能测出少量抗原和抗体，所以应用范围较广。

其它方法：荧光抗体技术,   ELISA,   免疫组化