致病性(致泻性)大肠埃希氏菌及其检验（下）

二、中毒机制与主要症状

1. 中毒机理     肠道内感染的机制如下：

1)肠毒素型大肠杆菌(ETEC)：主要引起腹泻(幼畜或雏鸡)，约有40个血清型。肠毒素型菌株进入肠道后主要在小肠内繁殖，不损害肠上皮细胞。繁殖过程中产生肠毒素。

2)肠致病型大肠杆菌(EPEC)：是引起婴儿腹泻的主要病原菌，该菌不产肠毒素，也无侵袭力，致病机理不清，约有18个血清型。

3)肠侵袭型大肠杆菌(EIEC)：较少见，该菌不产肠毒素，但侵袭大肠肠壁上皮细胞，引起炎症反应，形成溃疡，约有8个血清型。引起类似痢疾的症状。

2. 主要症状：a.肠道内感染主要造成腹泻与痢疾样疾病；肠道外感染主要引起尿路感染，新生儿脑膜炎，败血症及其他部位的感染。b.大肠杆菌引起的食物中毒是感染型和毒素型的综合作用。主要症状为急性肠胃炎，潜伏期为12～24h，临床出现呕吐、腹泻、发热(一般不超过39℃)、头痛、腹痛等，病程一般为1～3d。

三、检验

•        检验方法  包括增菌、细菌分离、生化试验、大肠杆菌致病性鉴定(血清学试验、毒素检测等)。

•        致病性大肠杆菌的检验程序 见GB/T 4789.6-2003)

1. 增菌2. 细菌分离 3. 生化试验4. 血清学试验 5. 毒素检测6. 结果判定与报告

增菌培养   1、以无菌操作称取样品25g，加入225mL营养肉汤培养基中，可用灭菌砂在研钵中磨碎或以均质器打碎样品。2、取适量接种于乳糖胆盐培养基中，测定大肠菌群MPN；其余移入500ml三角瓶中于36±1℃培养6h。挑取一环，接种于一管30mL肠道菌增菌肉汤中，42℃增菌培养18h。

分离培养   1、将发酵乳糖阳性管液和增菌液分别划线接种于麦康凯或伊红美兰琼脂平板上2、于36±1℃培养18～24h观察菌落   对于污染严重的食品可直接按划线法接种，不经过增菌过程。

生化试验在鉴别平板上挑取菌落5个以上，分别接种于TSI琼脂(或克氏双糖铁)，以及pH7.2尿素、蛋白胨水、半固体、 KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶培养基中。经36 ℃ 培养18～24h。TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性、KCN阴性和尿素酶阴性的培养物为大肠埃希氏菌。 TSI底层不产酸，或H2S、KCN和尿素酶任何一项阳性的为非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。

血清学试验    假定试验：从平板上挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌的培养物，用EPEC、EIEC、ETEC三种多价O血清和EHEC　O157诊断血清做玻片凝集试验。不凝集的培养物可做阴性报告。当与某一多价O血清凝集时，再用该多价血清包括的单价O血清分别做试验，出现凝集即为假定试验阳性。

证实试验：单管凝集试验  (O抗原＋1﹕400血清)

肠毒素试验    ELISA检测LT和ST：①LT检测方法(双抗体夹心法) ②ST检测方法(抗原竞争法)。双向琼脂扩散试验检测LT；乳鼠灌胃试验检测ST。

双向琼脂扩散试验：将被检菌按5点环形接种于Elek氏培养基上，以同样操作共做两份，36±1℃培养48h，在每株菌的菌苔上各放一片多粘菌素纸片，36+1℃经5～6h，使抗生素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5mm处的中央，挖一个直径4mm的园并用一滴琼脂垫底。在一份平板的孔内滴加LT抗毒素30ul，另一份平板的孔内滴加ST毒素30ul。放于36+1℃经15～20h观察结果，在菌斑和抗毒素之间出现白色沉淀带为阳性，无沉淀带者为阴性。

乳鼠灌胃试验：每1mL检样滤液加入2%依文思兰溶液0.02mL作为标记。选择1～4日龄的乳鼠，用装有塑料小管的注射器将0.1mL检样注入乳鼠胃内，每组注射3～4只。禁食3～4h后用氯仿处死，拉出全部肠管并称重(包括积液)，与剩余体重比较。若肠管重量与剩余体重之比大于0.09，判为阳性；比值为0.07～0.09，可疑。本法主要用于测定ST。