真菌检验技术的进步

真菌检验的临床重要性日益增加。传统的真菌培养和鉴定技术需时较长，且深圳特区部真菌感染的病原菌常不易培养成功，成为实验诊断的难点。

      近年来，真菌感染的快速实验诊断技术正在努力解决这一问题。一、应用分子生物学技术自临床标本中检出真菌DNA；二、应用单抗和免疫学技术自临床标本中快速检出真菌抗原；三、利用真菌的特异性酶快速诊断真菌；四、常规培养与鉴定技术的进步，现分述如下。

 

一、 常规分离、鉴定技术的进步

      利用酵母样真菌在生长过程中形成的酶，作用于培养基中的色原底物，使菌落呈现不同的颜色，此种CHROMO AGAR的应用，利于快速分离与初步鉴定酵母样真菌。

      酵母菌的常用鉴定系统已有以AP120C为代表的手工法，以ATB32C为代表的半自动法，以AMS（vitek,vitek 2）为代表的自动代法借助于AMS的YBC卡的生化反应，应用人工双歧层次分析鉴定法（Dendrogram Hierarchy Process Analytic identification Method,DHPA）可使鉴定正确率提高。

      利用酵母菌生长过程中形成的予成酶（Preformed Enzymes）作用于合成的色原底物而制成的成套微量鉴定系统Rap ID Yeast plus System(RYP,美国Innovative Diagnostic System公司)，可于4小时完成酵母菌的快速鉴定，与应用API20C的一致率达97.3%。

      平滑念株菌可利用其快速分解菌藻糖（Trehalose）而迅速鉴定。用4%菌藻糖的0.1μmol/L枸橼酸缓冲液，取待鉴定菌落浓涂入液中，37℃温育3h，以尿葡萄糖试纸检测，如在2分钟内显色（阳性）即为平滑念珠菌。经与传统鉴定方法比较，此法的敏感性98.8%,特异性99.1%.

      都柏林念珠菌的临床重要性在增长，其简易可靠的鉴定试验为该菌在42℃不能生长，且β-D葡萄苷酶为阴性。

二、 自临床标本中直接检查抗原

      深部真菌感染者血中难于培养出菌体，尤其是丝状真菌菌体常粘附、缠绕于组织，血中不易出现。但组织中菌体可溶性抗原可吸收入血自血、尿或感染组织液中直接检查真菌抗原为快速诊断的重要手段；虽也可检查抗体，但难达快速诊断。

（一）、检测念球菌属的甘露聚糖及其抗原

1．胶乳凝集试验（Sanofi Diagnostics Pasteur公司）

取300μl血清，加100μlEDTA处理液，混匀，煮沸3min，离心10000×g10min，取上清40μl加10μlSanofi胶乳粒子，3min内出现凝集为阳性。

2． EIA法。以单抗包被酶标板，用双抗体夹心法检查血清中念球菌抗原（Behring Diagrostics公司试剂）

3．检测血中的白色念球菌的甘露聚糖抗体。ENA法检查中甘露聚糖对念珠菌感染的诊断敏感性40%，特异性98%，ENA法检查甘露聚糖抗体对念珠菌感染的诊断敏感性53%,特异性94%。

4．检查血清中D-阿拉醇或D-阿拉伯醇与L-阿拉伯醇的比值可快速诊断念珠菌病。Yeo等用基因重组的D-阿拉伯醇脱氢酶以酶荧光法定量，发现念珠菌感染者血清中来自菌体的D-阿拉伯醇明显升高，用此法迅速论断新生儿的侵袭性念珠菌病。

Mitsutake等比较了自39名深部念珠菌病患者血液中检出抗原的四种方法。应用斑点印迹法检查其烯醇化酶（Enlase）抗原的阳性率71.8%，特异性100%；应用胶乳凝集检查热敏性糖蛋白抗原阳性率76.9%，特异性87.5%；应用胶乳凝集检查甘聚糖抗原阳性率75.6%，特异性100%，应用鲎试试验检查细胞壁组分β-Glucan的阳性率84.4%，特异性87.5%。

（二）、肺曲菌病的血清抗原检查

1．胶乳凝集试验（Pastorex Aspergillus,法国Sanofi公司）检查血清中半乳甘露聚糖（Galactomannan）。方法如上述胶乳凝集试验。

2．单抗ELISA法检查血清中半乳甘露聚糖抗原（法国Sanofi公司），敏感性达1.0ng/ml。

3． DELFIA法。Eu标记的时间分辨荧光分析法（芬兰Wallac公司试剂）敏感性达0.5ng/ml。

（三）、血清中查组织胞浆菌抗原

以此菌荚膜的69-70kd抗原制出单抗以ELISA法检出可及时明确诊断。

（四）、尿中检查马尼菲青霉菌抗原

以该菌外壁的膜蛋白为抗原制出单抗，以ENA法诊断33例患者，52例健康人和248例无真菌感染的住院患者均为阴性。本法的特异性98%，敏感性97%，阳性予示值84%，阴性予示值99.7%。

（五）、新形隐球菌的抗原检查

新形隐球菌具有荚膜多糖抗原，可以单抗致敏的胶乳凝集试验快速检出。其荚膜多糖的主要成分为Glucuronoxylomannan，以此抗原的单抗包被酶标板，以双抗体夹心法检出抗原，血清稀释1：8为阳性。Feldmesset用此法自AIDS患者引发新形隐球菌性脑膜炎的血清中检出抗原而及时诊断。

（六）、深部丝状真菌感染的抗原检查。

丝状真菌的细胞壁成分含（1→3）β-D葡聚糖，可用鲎试剂（鲎凝固酶）检出。以20μg/ml为界限值。文献报告检查41例深部丝状真菌感染者，37例阳性，敏感率90%，特异性100%。

三、 检查真菌的特异性酶

白色念珠菌具N-乙酰-β-D半乳糖苷酶和脯氨酸氨肽酶，如用适当底物检测，此两酶同时阳性，即可确定。都柏林念珠菌只具N-乙酰-β-D半乳糖苷酶。克柔念珠菌具酸性磷酸酶，热带念珠菌具吡咯磷酸酶，平滑、副平滑念珠菌具β-D半乳糖苷酶，新形隐球菌具酚氧酶，均可用适当呈色底物快速完成鉴定。

四、 分子生物学技术

（一）、用PCR等技术字标本中扩增真菌DNA。国内应用PCR与反向斑点杂交快速检测及鉴定念珠菌主要种别。国外可以用PCR-DEIA技术从血清中扩增出白色念珠菌的DNA来诊断念珠菌病。

针对真菌的共同序列而设计的‘全能引物’（pan-primer）而扩增580bp的产物，为真菌所共有。检测血液标本即可明确体内有无真菌感染。

（二）、用于真菌的型别分析。国内应用随机引物PCR扩增后进行真菌分型，结果可靠。应用随机引物扩增物多态性分析（RAPD）可以将5种曲霉菌鉴别开（烟、黄、黑、土、构巢曲霉）。国外结合PCR与酶标记探针在纸条上进行检测（LiPA,line probe assay）可鉴别出主要的致病性真菌。

（三）、检出念珠菌的基因变异快速确定念珠菌对酮康唑的耐药性。此种耐药性由基因的1554T突变为C而致，应用Lightcycler仪器，以荧光共振能量转移和基因片段溶解温度曲线技术测定。