霍乱弧菌及其检验

 

1．分类

 

（1）血清分型 霍乱弧菌（V.cholerae）有不耐热的H抗原和耐热的O抗原。前者为共同抗原，特异性低，后者具有群特异性和型特异性，是霍乱弧菌分群和分型的基础。根据O抗原的不同，霍乱弧菌现有155个血清群，其中仅O1群和O139群引起霍乱。O139血清群是新出现的型别，与O1群抗血清无交叉反应，但可与O22和O155血清群产生交叉反应，遗传学特征和毒力基因与O1群相似。O2血清群～O138血清群可引起人类的胃肠炎，无明显的季节分布，不引起霍乱流行，不被O1群霍乱弧菌多价血清所凝集，称之为非O1群霍乱弧菌，以往也称不凝集弧菌或非霍乱弧菌。

 

O1群霍乱弧菌的O抗原由A、B、C三种抗原成分组成，A是O1群的群特异性抗原，通过三种抗原成分的不同组合可分成三个型别:AB构成小川型、AC构成稻叶型、ABC构成彦岛型。彦岛型的抗原性不稳定，各型之间可以相互转换，以小川型和稻叶型为常见流行型别。

（2）生物型 根据生物学特性，O1群霍乱弧菌可分为古典生物型和El-Tor生物型，两个生物型具有相同的血清型。El-Tor生物型是具有溶血性的生物型，现发现El-Tor生物型细菌在环境中的抵抗力、存活力更强，在我国流行的以El-Tor小川型为主。

 

（3）噬菌体分型 根据霍乱弧菌对噬菌体的裂解模式不同进行分型，得到32个型，其中第Ⅳ组和第Ⅴ组噬菌体较为实用，前者以裂解古典生物型为主，后者仅对El-Tor生物型有高度特异性。

 

2．细菌特性

（1）形态染色 革兰染色阴性，呈弧形或逗点状，菌体尾端有一鞭毛，运动活泼，悬滴镜检可见穿梭状运动，患者粪便直接涂片可见弧菌纵列呈“鱼群”样，O139群弧菌亦为单端单鞭毛，有荚膜。

（2）培养特性 需氧或兼性厌氧菌，在16～44℃均可生长，最适生长温度37℃；营养要求不高，在普通培养基上生长良好，耐碱，在pH6.8~10.2范围均可生长，一般增菌培养常用pH8.4～8.6的1％碱性蛋白胨水进行选择性增菌。常用的选择性培养基有硫代硫酸钠-枸橼酸盐-胆盐-蔗糖琼脂平板（TCBS平板），霍乱弧菌发酵蔗糖产酸，菌落呈黄色；4号琼脂和庆大霉素琼脂平板，因含亚碲酸钾，霍乱弧菌在其上生长将培养基中的碲离子还原成元素碲，形成灰褐色菌落。血平板上菌落较大，El-Tor生物型可形成β溶血环。可在无盐培养基上生长，但在含有高于60g/L氯化钠的培养基上不能生长；O139群霍乱弧菌能在无盐及30g/L氯化钠蛋白胨水中生长，不能在80g/L浓度下生长。

（3）生化反应 氧化酶、明胶液化和吲哚试验阳性，发酵蔗糖和甘露醇，赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶阳性，精氨酸双水解酶阴性。霍乱弧菌古典生物型和El-Tor生物型的区别见表12-1。

 

                   表12-1 霍乱弧菌古典生物型和El-Tor生物型的区别

 

 

注：+，≥90％阳性；-，≥90％阴性；D，10%～89%阳性。

（4）抵抗力 霍乱弧菌对干燥、热、酸和消毒剂均敏感，但在自然环境中存活时间较长， O139群霍乱弧菌在水中存活时间较O1群霍乱弧菌长。

3．临床意义

霍乱弧菌O1群和O139群是烈性肠道传染病霍乱的病原体。在自然情况下，人类是霍乱弧菌的易感者。人通过摄入霍乱弧菌污染的食物或水，引起霍乱。进入肠道的霍乱弧菌通过鞭毛运动穿过肠黏膜表面的黏液层，接近肠黏膜上皮细胞，通过普通菌毛的作用定植。肠道内的环境有利于霍乱弧菌的繁殖，产生霍乱肠毒素，导致疾病的发生。

霍乱弧菌的主要致病因素是霍乱毒素（cholera toxin，CT），CT是目前已知的致泻毒素中最强烈的毒素,可造成肠液大量分泌，导致严重的呕吐和腹泻，使体内水分和电介质大量丢失，形成严重的水样腹泻综合征。

 

4.微生物学检验

 (1)检验程序

(2) 标本采集 霍乱是烈性肠道传染病，检验标本主要以病人的大便为主，必要时呕吐物和被呕吐物污染的衣裤亦可作为标本。一般采取新鲜粪便，或用棉拭子插入直肠内4～5cm采取。病人标本最好床边接种，预计能在3h内进行培养者，可将肛拭子置于灭菌的含碱性蛋白胨水的试管中，或将10～15ml大便放在带盖的广口瓶中，送往实验室。不能在3h内进行接种或需送至较远实验室的，应将标本转至卡-布半固体运送培养基中送检，避免使用甘油盐水缓冲运送培养基。送检标本应密封并派专人送达。

（3）检验方法

1）显微镜检查 ①涂片染色:取病人“米泔水”样或黏液絮状粪便标本直接涂片，革兰染色或1：10稀释复红染色，镜检；一般新鲜粪便中弧菌较典型，排列呈“鱼群”状，菌株随人工培养传代次数增加或菌落放置过久而逐渐变为不典型的短杆状；②动力观察：可用悬滴法、压滴法或暗视野显微镜观察动力，霍乱弧菌运动活跃，新鲜粪便标本中常呈“穿梭样”或“投标样”运动；③制动试验：将病人“米泔水”样粪便或6h的增菌液0.25ml同0.25ml适当稀释的霍乱多价“O”免疫血清混合，5min后作暗视野或悬滴法检查，并以生理盐水与标本混合作为对照，有免疫血清存在时，菌体凝集成块，动力消失；④直接荧光抗体染色检查和O1群抗原单克隆抗体凝集试验，可快速诊断霍乱弧菌感染。

2）分离培养 将标本直接接种于碱性蛋白胨水，或将运送培养基的表层接种于碱性蛋白胨水中35℃6～8h后，转种至TCBS琼脂或4号琼脂或庆大霉素琼脂平板，35℃培养12～18h观察菌落形态，TCBS上出现黄色菌落，4号琼脂或庆大霉素平板上出现灰褐色中心的菌落，均为可疑菌落，应使用O1群和O139群霍乱弧菌的多价和单价抗血清进行玻片凝集试验，结合菌落特征和菌体形态，作出初步报告。

将与抗血清凝集的菌落进一步纯培养，依据全面的生化反应、血清学分群及分型进行最后鉴定。符合霍乱弧菌的菌株尚需区分古典生物型和El-Tor生物型（表12-1）。

3）鉴定 用于霍乱弧菌的鉴定试验有：①霍乱红试验:霍乱弧菌的两种生物型均呈阳性反应，但是，本反应并非霍乱弧菌特有，许多能分解色氨酸和还原硝酸盐的细菌，均能产生阳性反应；②糖发酵试验:霍乱弧菌分解葡萄糖、蔗糖、甘露醇产酸不产气，不发酵阿拉伯糖；③粘丝试验:弧菌属细菌除副溶血弧菌部分菌株外，均有此反应；④O/129敏感试验：参照药敏试验方法进行。将O/129 10μg和150μg的纸片贴在接种有待测菌的琼脂平板上，35℃孵育18～24h后，纸片周围出现任何大小的抑菌环均为敏感；O1群和非O1群霍乱弧菌均敏感，但已有对O/129耐药的菌株出现；O139群对O/129耐药，用此试验作鉴定时需特别谨慎，需结合其他试验结果加以综合考虑；⑤耐盐试验:霍乱弧菌可在不含氯化钠和含有6％氯化钠培养基中生长，氯化钠浓度高于6％则不生长。

4）霍乱弧菌的生物分型试验 见表12－1，这些试验中，每种试验都可能或多或少地存在例外情况，可根据实验室具体情况采用数种试验，多数符合，一般情况下即可判定霍乱弧菌的这两个生物型。

（4）耐药性 致病性弧菌在MH培养基上生长良好，可用NCCLS规定的纸片扩散法进行体外抗生素药敏试验，常规测定氨苄西林、四环素、氯霉素、SMZ-TMP、呋喃唑酮。对于具有自限性的腹泻而言，体外药敏试验并非必需，但对监控弧菌的耐药性发展趋势有意义。

（5）结果与报告 霍乱属于法定的甲类传染病，一旦从病人粪便标本中分离出霍乱弧菌，需立即向上级管理部门报告。