土壤中稀有放线菌的分离、纯化和鉴别

 一、目的和要求

　　1、了解采集土样的要求和方法。

　　2、掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术。

　　3、学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。

　　4、学习并掌握抗生菌的鉴别方法。

　　筛选放线菌是新抗研究的重要课题之一。迄今为止，已发现的抗生素有80%皆来自于放线菌。放线菌主要存在于土壤中，并在土壤中占有相当大的比例。一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。通常，随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌。若以常规方法进行分离，得到的几乎全部是链霉菌。然而，当采用加热处理土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。由土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法，并通过选用特殊培养基的方法，来获得少量稀有放线菌。

　　由土壤中分出的放线菌需进一步鉴别是否为需要的抗生菌。首先应根据筛选目的确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。其主要依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。本实验选用了这两种方法。

　　1、培养基：葡萄糖天门冬素琼脂，精氨酸琼脂，高氏1号琼脂，以上每种培养基皆用500ml三角瓶分装250ml。

　　2、灭菌物品：牛皮纸袋，培养皿，1ml、5ml吸管，250ml三角瓶分装90ml无菌水（含30粒玻璃珠），18×180mm试管分装9ml无菌水，牙签，玻璃刮铲，18×180mm试管中分装10 ml 1‰K2Cr2O7母液。

　　3、试验菌：

　　　　（1）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

　　　　（2）大肠杆菌（Escherichia coli）

　　　　（3）金黄色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）

　　　　（4）深红酵母（Ruodotorula rubra）

　　4、其它：采土铲，细目筛，药勺，称量纸，试管架，小天平，记号笔，打孔器，游标卡尺、镊子，圆滤纸片，15×150mm试管分装5ml无菌水，1ml吸管，无菌漏斗。