大肠杆菌质粒的抽提

苯酚/氯仿溶液抽提法

1. 接种5ml LB，37℃摇床过夜培养（12小时）

2. 离心，3000rpm，5min去上清

3. 振荡混匀沉淀，分装在2个离心管中，spin一下，吸去上清，加入150μl的溶液I （50mmol/L葡萄糖,  25mmol/L  Tris•Cl(PH8.0),  10mmol/L EDTA(PH8.0) 在10lbf/in2（6.895×104Pa）高压蒸气下灭菌15min（8磅），贮存于4℃），剧烈振荡5分钟打散菌体（菌体不打散容易在产物中出现较多蛋白）。

4. 加入300μl溶液II（0.2mol/LnaOH, 1%SDS, 用2倍的溶液现配现用）后立即振荡混合均匀，处理2分钟后加入225μl溶液III（5mol/L乙酸钾 60ml，冰乙酸 11.5ml，水 28.5ml）混合均匀，12000rpm离心5min，取上清液中于新的离心管。

5. 加120μl酸性苯酚/氯仿溶液，振荡混匀，12000rpm离心5min，再取上清液中于新的离心管中。

6. 用120ul氯仿重复操作5。

7. 加等体积的异丙醇或2倍体积的乙醇，混匀，12000rpm离心7min。

8. 沉淀用70%乙醇洗涤两次,每次10min。50℃烘干后加适量无菌去离子水（ddH2O）溶解，-20℃保存。

 

 

氯化锂抽提法

1. 前四部同苯酚/氯仿溶液抽提法（用Solution I II III处理）

2. 加等体积的异丙醇，混匀，沉淀DNA，12000rpm离心7min。去上清，尽量去干净。

3.用少量70％乙醇洗一下（洗去异丙醇），离心去尽酒精，50℃烘干沉淀，用适量ddH2O（100ul）充分溶解（可在50度水浴中助溶）后加入4/5体积的氯化锂溶液（浓度约10mol/L）处理1min沉淀RNA和蛋白。

4.12000rpm离心5min，取上清液于新的离心管中，用等体积的异丙醇混匀，12000rpm离心8min，去上清。

5. 将沉淀用70%乙醇洗涤两次,每次10min。50℃烘干后加一定量的无菌去离子水（ddH2O）溶解，-20℃保存。

 

酶连反应

一般采用10μl反应体系：

T4连接酶 1μl ，连接酶缓冲液1μl ，外源片段与载体按DNA 摩尔含量3:1加入即可。

如果是粘端连接，则需把外源片段和载体的混合物在50度处理10分钟使粘端变性，然后立即放入冰中5分钟。

平端连接采用14度，粘端连接采用16度，连接4小时以上（一般可过夜）。

＊外源片段与载体按DNA 摩尔含量为3:1或外源更多。