植物内生微生物群落的研究和应用价值

   在以前极少听到过：某一微生物（或群落）具有降解和代谢F*B菌代谢排出的有毒、有害的化合物的能力。也极少听到过：以某种方式，在一定条件下，通过群落自身调控能力，对其自身种群进行改良，使种群获得新的功能、或新的性能、或新的酶系等。还极少听到过：某一植物内生微生物群落能很自然的、顺理成章的把进化的含义添加进入微生物发酵机理（原理）中，使有些发酵过程成为菌种改良的过程，进化的过程，给予微生物发酵机理（原理）新的内涵。

 

    当发现植物内生微生物群落（以下简单称为群落）时，从生态学可知，群落的种群之间存在着协同进化之关系。而且群落种群的生态位达到界域时，即群落由一种原生动物、一种细菌、一种真菌、一种古生菌组成。这样的群落适应新环境的能力会更广、更大、更强。

 

    首先介绍这一植物内生微生物群落的一个特性。由于群落的进化历程使它具有以下特性，那就是把群落与外植体（植物）组织细胞投放进一个装有水溶液的容器内，水浸过外植体，密封容器，使容器内趋向于缺氧状态，这时群落种群会很快侵入到组织细胞内。在短期内群落与组织细胞相互作用，使群落与组织细胞处于相对平衡状态，即趋向于共栖或共生关系。而不是对寄主细胞采取掠夺方式，将吸取寄主细胞内的大部分蛋白质、脂肪、碳水化合物而使寄主细胞很快死亡。同样将上述外植体和水换作牛乳汁，群落种群也会很快侵入乳脂肪球和酪蛋白胶束内。

   

实验之一：

1）把新鲜橙子（果实）洗净且切成数片与群落菌种一起投放进装有水溶液的实验发酵容器中，水浸过橙子（但橙子量过多），密封容器，进行缺氧发酵。

2）由于发酵时，部分发酵液喷溢出来，使上面部分橙子露出水面，20d发酵结束后，容器内空气中残留的好氧F*B菌很快侵入露出水面的橙子，随着F*B菌的生长及代谢排出许多有毒、有害的代谢产物。不久露出水面的橙子中的营养被消耗殆尽，又由于缺氧以及F*B菌代谢出的有毒、有害代谢产物的抑制，使F*B菌进入了衰亡期。

3）由于F*B菌生长代谢所分泌的有毒、有害的代谢产物将严重影响水溶液中的群落生境，为了生存，维持原来的生境，这时群落中的真菌就从F*B层中生长出来，经过一定时间后，F*B层中的物质几乎都被分解、降解、转化成为有用物质，被真菌代谢利用，从而形成一层菌苔。终于完成保护群落的生境的任务。

4）发酵液仍然保持清澈透明，打开容器，发酵液仍然挥发出天然橙子的香气，没有F*B气味和异味。

5）分析：原来群落中真菌不可能具有如此丰富、复杂的酶系，能将如此复杂的F*B的有害、有毒化合物降解，并被真菌代谢所利用，这里需要进行一系列非常复杂的生物化学反应，难度之大可想而知。因此这其中过程，极可能是：真菌从F*B层中生长出来，并对F*B层的基因信息和信息分子等进行识别、收集、整理，而群落中的其他种群也分工协作，有的对信息分子进行响应；有的对基因信息进行基因修饰、基因变异，产生遗传变异体，即相应的酶系；有的对基因信息进行表达、构建，有的负责对构建的遗传基因进行传递等，真菌在群落这种支撑下，完成了对F*B层中有毒、有害化合物的降解和代谢，保护了群落原来的生境。并且使真菌自身得到了改良，获得了新本领。

实验之二：

  所作实验分为三组，一组是对照组，不投放任何菌种；二组是只投放群落中的真菌菌种组；三组是经二次投放菌种，才能完成投放完整的群落菌种。培养物是新鲜牛乳汁。

  实验目的：观察群落能否在新环境（即经初次杀菌的新鲜牛乳汁）中生长、代谢，并成为乳液中的主要微生物菌群，且维持乳液（生境）不被破坏（即在室温下，维持牛乳汁20~30d不变质）还能增加牛乳的风味物质。

  实验所用乳液要同一批次，操作和接种环境要相同。

 

实验步骤：

1）新鲜牛乳经摄氏59~68度，15s的初次杀菌。

2）分装到已灭菌的实验瓶中，分装量为容器的容积的1/2，每组3瓶，分为三组。

第一组为对照组，不接种但空的接种操作仍然进行；

第二组仅接种一次，菌种为群落中的真菌；

第三组第一次接种与第二组相同，48h后进行第二次接种，接种完整群落的菌株；

都盖上瓶盖，用保鲜膜（多层）包扎好瓶口。

3）观察实验过程

大肠杆菌可溶性蛋白表达及抽提（用于由IPTG诱导的表达体系）：

可溶性蛋白的表达没有固定的方法，对不同的蛋白会有不同的方法，如果抽出的可溶性蛋白不多，可用基本培养基代替LB，用30或25度培养代替37度，IPTG（诱导物）的量也可减少，诱导时间也可变化。下面的方法仅供参考:

1． 将菌接种于5ml LB（含抗生素）培养基中过夜培养，

2． 将过夜培养物全部接种到200ml含抗生素的 MM培养基中，37度培养4-5小时，加IPTG至终浓度0.5mM（可变），37度培养13小时。

3． 将细胞培养物用20mM的冰冷的Tris-HCl（pH=7.5）浓缩10倍，

4． 在冰上用超声波处理（power lever为4-5，duty设为40－50％，60-120次脉冲，每30次脉冲后在冰中放30秒冷却），

5． 4度10000rpm离心10分钟,

6． 将上清通过0.45um的滤膜（细菌过滤器）

附：MM培养基（1L）

硫酸铵1g，磷酸氢二钾0.5g，7水硫酸镁0.2g，7水硫酸亚铁0.1g。