食品中霉菌和酵母分布、检测和鉴定（2）

 

4．霉菌和酵母总数测定

4.1 基本要求：霉菌培养应用专用培养箱，培养温度在25～30℃之间对结果影响不大。为尽快得到结果，我们以27℃为培养温度。菌落计数应于培养后的72小时进行第一次观察。这时主要是观察那些密集生长的平皿，以免到第五天之后，菌落生长成片而难以计数。

 

　　实验时手脚要快，动作宜轻，培养过程中观察平板时，动作稍重，生长快速的霉菌孢子就会在培养基内扩散，导致二次污染，结果读数异常。特别是翻转平板进行培养，观察时再转过来，特别容易导致孢子飞散。一般以第五天的读数为最终计数。但观察应持续七天。

 

　　由于霉菌和酵母菌落较大，光线正常时可以方便地计数。选择那些霉菌数为10～100个之间的平皿计数，而不是象细菌的30～300个。有时10～50个菌落的平皿也是受肯定的。

 

霉菌和酵母培养时间较长，用于倾注的培养基量应稍多于细菌计数，约为15～20 mL，以保证培养时不至于造成培养基过分干燥。培养箱内温湿度调节不当，会造成霉菌蔓延生长或培养基失水。尤其是当湿度过高时，常导致嗜湿的根霉、木霉、毛霉、链孢霉等的强烈污染。当然，每批实验时空白对照都是要做的。

 

4.2 霉菌和酵母计数培养基

传统霉菌和酵母计数时用酸性培养基来抑制细菌。酸化的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）是一致公认最好的酸化培养基。用酸，如酒石酸调pH至3.5后用于计数，效果尚令人满意。酸化培养基也有无法避免的缺点，如霉菌菌落的扩展，耐酸细菌的生长，蛋白质出现沉淀，以及抑制了不耐酸霉菌和酵母的生长等。最后还有一点，生长在酸化培养基上的霉菌和酵母形态异常，不利于分类鉴定。

 

目前普遍使用抗生素培养基，上述缺点明显改善。此方法经济有效，培养基易制备，不会破坏正常的菌落形态。常用的抗生素类药物有氯霉素（50～100 mg／kg）、土霉素（100 mg／kg）、硫酸庆大霉素（50 mg／kg）、链霉素（3 g／kg）、盐酸金霉素（20 mg／kg）等。两种抗生素合并使用效果更好。硫酸庆大霉素和氯霉素耐高压，可以预先添加在培养基中一起灭菌，而其他的抗生素一般在培养基温度降至50℃以下后添加。注意，抗生素效用在碱性条件下（pH＞8.0）降低。

 

　　孟加拉红（Rose of Bengal）常被用于制备霉菌和酵母的计数琼脂。主要作用是限制霉菌菌落的蔓延生长，而不是象某些书本所描述的那样，用于抑制细菌。孟加拉红也被称为虎红，化学名是四碘四氯荧光素钠盐或钾盐。添加孟加拉红的培养基上生长的霉菌菌落较为致密，而且生长的菌落背面显出较浓的红色，有助于计数。唯一的缺点是孟加拉红溶液对光敏感，易分解成一种黄色的有细胞毒作用的物质。平时应将孟加拉红溶液用不透光的容器或袋子包好，贮存在冰箱中。已变黄的溶液和琼脂应弃去。著名的应用孟加拉红的培养基是马丁琼脂（Matin's Media，亦称虎红琼脂、孟加拉红琼脂）。孟加拉红可添加在PDA中。邻氯对硝基苯胺（2 mg／kg）有类似孟加拉红的作用。国外学者也常用孟加拉红琼脂，其中添加孟加拉红25 mg／kg，另外附加邻氯对硝基苯胺2 mg／kg，氯霉素50 mg／kg，金霉素50 mg／kg。美国FDA尚未认可孟加拉红琼脂，它的标准仍以PDA的酸化法和抗生素法为基本。

 

国家标准规定，霉菌和酵母数检验时使用的培养基为孟加拉红琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）。原标准只要求做粮食霉菌总数时，使用高盐察氏琼脂。高盐察氏琼脂使用时也有抑制力过强的缺点，而毛霉和根霉等却仍然生长旺盛。一般使用CAO时，应同时使用孟加拉红琼脂，以反映食品真菌的菌相全貌。现在高盐察氏琼脂已废止。不过，标准中忘记删除流程图中的CAO。察氏琼脂（Czapek）和PDA通常只用于分类鉴定。

 

　　当酵母为优势菌群时，使用MEGA计数。配方：麦芽浸膏20克，蛋白胨1克，葡萄糖20克，琼脂20克，蒸馏水1升，调pH 5.4，121℃15 min，添加50 mg/kg氯霉素和金霉素以抑制细菌。如买不到麦芽浸膏，可以向啤酒厂购买麦芽汁（未添加啤酒花，without hops）代替。上述培养基均有干粉出售。使用时十分方便，但各品牌的质量不一。

 

4.3 霉菌和酵母计数方法

　　稀释平板法最常用于食品样品的检验。国家标准种样品处理等方法与细菌的菌落总数计数方法大致相同。事实上，可以在进行菌落总数计数的同时，进行霉菌和酵母总数的检验。两者之间的差异为培养基和培养温度的不同。

 

有人认为，霉菌和酵母计数用表面涂布平板法能提高检出率，因为霉菌有气生菌丝，好氧性强，酵母耐热性差，不耐融化琼脂的热力。而且可用不透明的培养基。检验方法同细菌检验常规，不再赘述。但因使用样品量较少，对含菌量少的样品，此法可能不够准确。

 

对于国家标准中规定的霉菌直接计数方法，引用了著名的霍华德（Howard）霉菌计数法，适用于检验番茄及其加工制品，但是需要专门的技术培训和相应设备。

 

5. 霉菌和酵母分类鉴定

霉菌中的多数种类不会产生有害的霉菌毒素，危害较小，而少数菌株即使污染数量不多，产生的霉菌毒素却有极大的危害，因此单纯的霉菌和酵母计数并不能反映食品的安全性，只有知道了食品的污染菌菌相，才能更准确地判断。分类鉴定的意义就在于此。但是，霉菌和酵母的分类鉴定十分繁琐。

 

5.1 分离和纯化：常用方法有直接点种法、划线法、稀释平板法。稀释平板法同常规检验，除了培养基用具选择性的外，还要求每皿中长出的霉菌菌落在十个左右，太多则影响分离效果。另外，如采用倾注法，长在琼脂深处的霉菌发育不良，无法观察其菌落特征。可改用表面涂布法。此方法手续繁琐，但所得种类较多。直接点种法将食物小颗粒直接种于分离培养基上，25℃培养2～3天后，用接种针挑取孢子或菌丝，转接于适当的琼脂斜面上待鉴定。此方法分纯效果略逊。划线法是用无菌水洗涤样品，用接种环沾取液体在分离培养基上划线分离。此法最简便，但可能遗落部分菌株。

 

5.2 真菌分类系统：全世界已知真菌有上千属，十万种。四十年多来，真菌的研究飞速发展，尽管在真菌超微结构、生理生化、医学真菌学、药用真菌学、真菌毒素、食用真菌人工培养开发等方面已经获得了很多进展，但是，真菌学仍然是微生物学的薄弱环节，还有待进一步深入研究。目前，在系统学方面，受到公认的分类体系不多。

 

5.3 酵母分类鉴定：酵母在真菌分类系统中分别隶属于子囊菌纲、担子菌纲和半知菌类。为方便起见，国际上仍沿用酵母（Yeast）这个非分类学名词。酵母分类以荷兰Lodder J.主编《The Yeast－A Taxonomic Study》(罗德，酵母—分类研究)1970年再版本为比较完整的系统。

 

鉴定一株酵母，要花费极大的人力物力。因其形态和生理方面的试验项目繁多，一般微生物实验室难以开展。分离酵母时，现在一般不用低pH培养，而以抗生素抑制细菌。嗜干酵母常规方法很难检出，因其要求低水活度，可以用浓缩果汁为培养基，或添加30％葡萄糖，稀释样品时也用30％葡萄糖溶液。浓缩果汁中此类菌数量不得超过1/50 mL。在检查分离抗防腐剂的酵母时，培养基添加0.5％醋酸能促进抗保鲜剂酵母的生长并抑制其他酵母。

 

　　鉴定时，先根据细胞形态特征进行属以上的判断，如是否有性繁殖，子囊孢子、掷孢子、冬孢子和担孢子数量、形态，无性生殖是出芽还是裂殖，有无假菌丝等等。种的确定主要以生理特性，尤其是糖类发酵或同化为依据，还要包括无维生素生长、酯酶活性、色素形成、同化硝酸盐、酯类产生情况、对放线菌酮抗性、低水活度生长等等生理特点，常常需要数周后才有鉴定结果。

使用API 20C或Biolog全自动细菌分类系统等可以大大加快检索鉴定速度。目前，上述设备及类似设备研制较多，但普及有一定难度，主要原因是其价格居高不下。这种全自动或半自动检索代表了今后微生物分类研究的发展方向。

 

5.4 霉菌分类鉴定

5.4.1 霉菌分类培养基：丝状真菌没有完整的分类系统，常用Smith系统。霉菌培养时常因不同的培养基而在生理和形态方面表现出极大的差异，故描述菌种时应注明鉴定培养基。最为常用的是察氏琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂，通常对青霉、曲霉菌种用察氏琼脂培养，其他霉菌则应选用PDA。对于镰刀菌属的菌种，必要时要选用六种以上的不同培养基来分别显示它的不同培养特征。对有特殊要求的霉菌，培养时也应满足其条件，低水活度食品如果酱、粮食中的嗜干霉菌，应使用大量添加蔗糖或食盐的高渗培养基。

 

5.4.2 培养时间：直接采用霉菌和酵母计数后的平板进行霉菌分类鉴定是可行的。但在培养5～7天时，菌种的形态特征不明显，不容易观察。通常于培养7～14天时鉴定。

 

5.4.3 染色液：制片时染色液是必需的。常用两种：乳酸品红液（百万分之一酸性品红乳酸溶液），染色速度快，尤其是幼龄组织上色快。胞壁组织清晰，适于显微摄影。1896年 Amann 氏发明的乳酸苯酚棉蓝染色液（10克石炭酸溶于10 mL热蒸馏水，再加入甘油20 mL、乳酸10 mL、棉蓝cotton blue 0.22克即成），折光率好，背景微蓝，细胞不变形，杀菌防腐防腐，且不易干燥，保持时间较长。

 

5.4.4霉菌鉴定程序：霉菌分类的困难关键在于培养特征的观察和描述。使用检索表时一定要对每一分类特征判断清楚，以免因一次错误而误入歧途。经常进行霉菌分类鉴定的单位或部门需要专人负责这项工作，临时人员是无法胜任的。

 

鉴定时先肉眼观察平板上生长的单个菌落，注意菌落颜色、质地等。然后用显微镜由低倍镜、高倍镜至油镜观察，注意菌丝形态、孢子梗、分生孢子和有性器官颜色、形态等。这是鉴定时一定要仔细观察的指标。

 

　　以曲霉鉴定为例。先进行察氏琼脂观察。曲霉在察氏琼脂上颜色和形态分化较好。根据菌落有无绿色调产生分成两大类。有时需要放几天才出现绿色，有的则在几周后褪去绿色。通常于培养7～14天时观察。分生孢子头幼龄与老龄时形态差别很大。可将生长待测菌株的平板或试管斜面直接置低倍显微镜下，先寻找分生孢子头，然后分别观察其初生与老龄的孢子头形态及孢子排列方式。分生孢子梗有光滑、粗糙、凸起、小刺等，有的极长。注意区别顶囊下面的缢缩和折痕。观察分生小梗列数时必须用油镜。用接种针挑取菌丝及孢子头，用染色液制片。同时，注意分生孢子形态，常见有球形、椭圆形、棒形、菱形等，还要注意表面是否光滑、刺、疣突等。有时，也要注意如壳细胞、闭囊壳、菌核有无及形态等。

 

　　逐一判断上述项目，按检索表可查出曲霉种属。有时，一种菌能形成两种孢子，如单互隔霉属、根串珠菌属、镰刀菌属、发藓菌属、毛葡菌属。应认真观察。

 

6．真菌实验室注意事项

考虑到霉菌孢子容易飞散而造成污染，霉菌和酵母检验应在单独的实验室中进行。尽量保持实验室安静，减少空气流动。由于霉菌实验室不能使用布或类似的纤维材料的窗帘，故应提醒操作人员不能在直射阳光下配制、分装稀释液、倾注平板以及取样，最好能安排流水作业，以使从稀释第一份样品到倾注最后一个平皿所用时间不超过20 min。由于霉菌所固有的蔓延生长特性，保存菌种不应使用棉塞，以免造成菌种交叉污染。耐高压的塑料套式试管帽可以选用。

 

每次实验前，对有可能导致霉菌污染的材料，应认真全面消毒。做完实验后，尤其是大量培养后，除在第一时间将霉菌培养物灭菌外，还要对培养箱、接种箱、实验室进行消毒。霉菌孢子对紫外线抵抗力较强，所以通常以甲醛熏蒸，严重污染时可用10％甲醛喷雾。有文献推荐使用1％五氯酚钠喷布，可维持十五天药效。

 

另外，对所使用的菌株致病性或产毒能力应有充分的了解，并作好相应的防护工作。