(三) 操作实例
1.赤羽病病毒(AKV)的滴定或纯化
(1) 于55mm直径的灭菌塑料培养皿中培养绿猴肾细胞(Vero)，使形成单层。细胞培养时间约3－4天，接种量约为2 000 000/ml个细胞。选取单层细胞全部覆盖，不留有空洞的培养皿用作试验。
(2) 用细胞培养液对AKV病毒作10倍倍比稀释至10-7并保存于4℃。
(3) 每个稀释度的病毒液接种3个平皿。
(4) 接种前弃去细胞培养液,用5mlPBS或细胞培养液冲洗单层细胞,然后弃去冲洗液。
(5) 每个平皿分别加入0.2ml病毒稀释液，对照组只用细胞培养液代替，置37℃二氧化碳培养箱吸附一小时，每15分钟摇动一次，以便使病毒均匀分布。
(6) 按第4步骤冲洗未被吸附的病毒。
(7) 取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的1.5％琼脂(预热)中，每个平皿加入7ml，置平台待冷却凝固后于37℃二氧化碳培养箱培养约2天，平皿需倒置。
(8) 取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的2％琼脂(预热)中，每个平皿加入5ml，置平台待冷却凝固后于37℃二氧化碳培养箱中培养至次日。
(9) 结果计算 求每组三个培养皿的蚀斑平均数，组间蚀斑数的差异应符合稀释度的规律 (即若10-2组平均100个蚀斑，则10-3组平均应在10个左右)，否则应考虑重新试验。以平均蚀斑数乘以病毒稀释的倍数再乘以5，即为每毫升病毒原液的蚀斑数。
(10) 选取特征性的若干蚀斑，分别以弯头吸管在琼脂层下吸取蚀斑以收获病毒，然后分别接种到预先制备的单层细胞培养瓶中进行增殖或传代。
(11) 本试验采用BHK21细胞，可应用于牛流行热病毒(BEFV)。
2.蓝舌病病毒(BTV)血清型鉴定试验(纸片法)
(1) 抗体纸片制备
① 取已知各种血清型毒株以1×107蚀斑形成单位接种绵羊, 接种后3-4周采血分离血清。
② 制备直径0.5mm的中性滤纸片，121℃15分种灭菌后保存于干燥环境。
③ 取上述滤纸片浸入不同血清型的免疫血清后真空冻干, 保存于4℃冰箱备用，使用前以灭菌水湿润。
(2) 病毒接种
① 用直径6cm的塑料培养皿培养BHK21或Vero细胞使成单层。
② 以103PFU/0.2ml被检蓝舌病病毒接种于细胞上, 吸附1h。
③ 洗去未被吸附的病毒，弃去洗液。
(3) 覆盖琼脂
① 取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的1.5％琼脂，每个平皿加入7ml，置平台冷却凝固。
② 在琼脂面上按梅花形图案放上不同型的血清滤纸片, 并做好记号。
③ 把平皿放置在37℃二氧化碳培养箱培养2天。
④ 真空吸出平皿中的滤纸片。
⑤ 取2倍浓缩的细胞营养液加入等量的2%琼脂，每个平皿加入5ml，重新置37℃二氧化碳培养箱培养2-3天, 待明显蚀斑抑制环出现。
(4) 结果判定 出现明显抑制蚀斑形成(即滤纸片位置下仍保持活细胞被染色)的免疫血清即为该被检病毒的血清型。
注：本试验方法同时可应用于鹿流行性出血病病毒(EHDV) 与蓝舌病病毒(BTV)的鉴别。
3.新城疫病病毒(NDV)分离
(1) 取疑似患病禽的组织用细胞培养液匀浆,离心沉淀后取上清液。
(2) 用16孔微量培养板制备鸡成纤维原代细胞。
(3) 细胞长成单层后吸去培养液，向每孔滴加0.1ml被检病料, 置37℃吸附2小时后弃残液。
(4) 制备1％琼脂的BME，置40－50℃水浴待用。
(5) 吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔0.5ml，使冷却凝固成覆盖层。
(6) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱培养48h。
(7) 制备含0.002％中性红的1%琼脂的BME，置40－50℃水浴待用。
(8) 吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔0.5ml，使冷却凝固成第二覆盖层。
(9) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养，48小时内观察结果。
(10) 挑出蚀斑下的细胞作病毒的进一步增殖和鉴定。
注：本试验方法在样品中病毒含量少的情况下比单纯用细胞培养分离要敏感。
4.试验用各种成份的配制
(1) 细胞营养液(用于稀释病毒)
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10倍199保存液 |
4ml |
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犊牛血清 |
0.8ml |
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3%碳酸氢钠 |
2.4ml |
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双蒸水 |
32.8ml |
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40ml |
(2) 两倍浓缩细胞营养液(配制首层琼脂用)
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10倍199保存液 |
20ml |
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犊牛血清 |
4ml |
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3％碳酸氢钠 |
12ml |
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1％二乙氨基乙基(DEAE) |
10ml(可选择) |
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双蒸水 |
54ml |
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100ml |
(置40－45℃水浴备用)
(3) 1.5％琼脂
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精制琼脂糖 |
1.5g |
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双蒸水 |
加至100ml |
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(0.112MPa高压灭菌15分钟，置40－45℃水浴备用。) |
(4) 含中性红两倍浓缩细胞营养液(配制第二层琼脂用)
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10倍199保存液 |
20ml |
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犊牛血清 |
10ml |
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3％碳酸氢钠 |
12ml |
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0.5％中性红 |
6ml |
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双蒸水 |
52ml |
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100ml |
(置40－45℃水浴备用)
说明：在第二层琼脂中，中性红的最终浓度应为1:5000－1:10000。
(5) 2％琼脂
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精制琼脂糖 |
2g |
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双蒸水 |
加至100ml |
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(0.112MPa高压灭菌15分钟，置40－45℃水浴备用。) |
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