微生物的保存技术（3）

 

4    传代培养保存法 

 

        尽管与上述方法相比，用传代培养保存法保存微生物的时间较短，且会使微生物在反复传代和适应的过程中发生变异，但由于其简便易行，加之一些不耐冷冻和干燥处理的微生物还需要用该法保存，所以， 传代培养保存法是所有使用微生物的单位都要采用的基本保存法。目前必须依靠传代培养保存的微生物仍为数众多。传代培养保存法主要是保存生活态的微生物，它又分为连续用培养基传代和连续用活宿主传代。斜面保存法和矿物油保存法是传代培养保存的两种最常用的方法。 

 

4.1   斜面保存法 

 

        斜面保存法是传代培养保存法的具体方法，其优点是简便，易于推广。但用该法保存微生物的时间不太长。由于在具体操作时需要多次传代，加之斜面培养基中又保持了一定的营养条件，因此，用这种方法保存的微生物还易产生变异。使用该方法保存微生物时，可将菌种接种在不同成分的斜面培养基上，培养至菌种充分生长后，放 4℃冰箱中保存。每隔一定时间进行接种培养后再行保存，如此连续不断。一般细菌、酵母、放线菌和霉菌均可用此法保存。

 

4.2   矿物油保存法 

 

        矿物油保存法是传代培养保存法的变相方法，也较简单，且保存时间可达 1年以上。矿物油保存法，即是将接种在斜面培养基的细菌经过培养后，加入灭菌的石蜡油并浸盖住整个斜面（ 覆盖的深度为 2cm ） ，使之与空气隔绝，以降低微生物的代谢率（ Gherna   1981） ，再将浸盖有石蜡油的斜面培养菌种置于约 4℃或室温保存即可。复苏的方法与常规再培养的方法类似。尽管这种方法可使保存的细菌 3年内不死，但不适于微生物的长期保存， 因为每隔几年就必须复苏、鉴定和再贮存，从而耗费人力和物力。霉菌、酵母菌和放线菌可用该法保存，一些不适于冷冻干燥的微生物用该法保存也有效。 

 

5    砂土保存法 

 

        产芽孢的细菌或霉菌和放线菌的孢子均可用此法保存。具体操作如下： 

        用 60目和 120目筛除去砂和黄土中的大颗粒，分别用 10％盐酸浸泡 2～4小时，再用水洗至中性，烘干后按 2份砂:1份土的比例混匀，装入小试管中高压灭菌（至少 3次），并作无菌检查，确认无菌后备用。在培养好的斜面菌种中加入无菌水，做成细菌芽孢或霉菌和放线菌孢子悬液后，取出一 定量加入上述处理好的砂土管中，置真空干燥器内，用真空泵抽干后再将砂土管置入盛有氯化钙干燥剂的容器内，密封后低温保藏即可。芽孢杆菌、产孢子的霉菌以及放线菌可用该法保藏 1～10年.少数微生物，如放线菌和一些生活在土壤中的产芽孢细菌能抵抗正常的冷冻操作，并保持活力和基因的稳定性。以 0～－20℃保存在营养培养基中的培养物，其细胞可存活 2年， 但一般认为这种细胞会被所形成的冰晶伤害。

        对某些短期保存的微生物而言，低温保存不失 为一种廉价而有用的方法。室温干燥可使大量的微生物死亡（Gherna 1981） ，但有少数细菌能够抵抗脱水干燥并存活相当长的时间，产芽孢的细菌特别适用于这种贮存方法。干燥保存法通常将微生物细胞转种在一个灭菌的固体培养基上，然后在真空中脱水。土壤、纸张或陶制有孔培养基（Ceramic bead medium）常用于此类目的。

        还可先将细胞悬浮在明胶液内,再将这种明胶滴在真空中干燥。一旦脱水，细胞必须保存在干燥器内。如果再放到冰箱内保存，细菌的活力会保持得更长久些。用这种方法贮存的样品复苏后，要用营养培养基再水合和再次培养。该法常用于一些重要细菌属（如根瘤菌）的保存。