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支原体检测之直接培养法


录入时间:2011-6-28 14:34:10 来源:青岛海博

直接培养法
 
  原理:
直接培养支原体于培养基中,观察其生长及菌落生成。 
  特点:
是目前最直接与灵敏之步骤,亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。 
  缺点:
培养时间长,须3-5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组,可能会造成污染。 
  材枓:dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸(厌氧缸长期培养易有污染,所以厌氧包应用无菌水,每次打开厌氧缸后,用70% ethanol擦拭内壁。) 
  培养基制备:
基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长,可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1:2000)至培养基中以防止其它细菌污染。 
 
 10x stock solution (1 liter) :称取50 g dextrose,10 g L-arginine HCl,溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中,保存于 -70℃。 
 
  液体培养基 (1 liter) :称取21 g之Difco PPLO broth,0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中,加热搅拌溶解之。灭菌121℃,15分钟。待温度降低至室温后,于无菌操作台内加入200ml马血清,100ml之15% yeast extract solution,及100ml解涷之10x stock solution,混合均匀后,分装至已灭菌之有盖螺旋试管中,10ml/管。保存于4℃,期限1个月。 
 
 固体培养基 (1 liter ):称取21 g之Difco PPLO broth,0.02 g phenol red,15g Bacto agar于600ml蒸馏水中,加热溶解之。灭菌121℃,15分钟。放在50℃水中浴中,待温度降低至50℃时,于无菌操作台内加入200ml马血清,100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution,混合均匀后,倒入60x50㎜之无菌培养皿中,5ml/培养皿。保存于4℃,期限1个月。 
步骤: 
取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液,接种于液体培养基中,置于37℃培养二周,观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后,分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上,将其倒放置于37℃厌氧箱培养,培养至少3星期,持续观察是否有支原体之菌落出现。 
 
另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液,涂抹在agar plate上,37℃厌氧培养3星期,持续观察是否支原体菌落出现。 
 
另作正负反应对照组,正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。 
 
结果判读: 
 
支原体生长较慢,所以先在液体培养基培养1~2周增殖后,再培养于agar plate上。需至少培养3星期后,才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。 
 
典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like),乃是由于支原体往agar下层生长所致,为圆形无色透明菌落,大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落,有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态(slime)。 
 
若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落,可将其自agar plate上切下,重新培养于液体培养基中,培养一星期后再种入agar plate,若是细胞则不会生长。

 

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