微生物无菌技术之灭菌方法（1）

采用无菌技术所达到的程度，可以是不同的。一般分为灭菌、消毒和防腐3个不同层次。灭菌指彻底、永久地消灭物体内外一切微生物；消毒指消除物体表面或内部的病原微生物；防腐则是抑制物体内外微生物的生长。在微生物学研究、微生物工业生产和大型手术中，为了获得可靠的结果、保证生产的顺利或避免感染，要求将器具进行灭菌，甚至连场地和环境也要进行严格的灭菌，而对于一般的食品，为了保证其营养成分不受或少受破坏，所以通常只须采取消毒和防腐措施。当然，我们通常在得了炎症时服用抗生素或磺胺类药物抑制体内的致病菌，也可以认为是无菌技术的应用。例如在培养某些需要生长较长时间的微生物或组织时，通常要加入抑制细菌生长的抗生素。

　　实现灭菌的方法很多，基本上可以分为物理学方法和化学方法两大类。

　　物理学方法主要包括加热、超低温、过滤和电离辐射等。

 

加热可以引起生命物质如蛋白质、核酸和脂类的破坏，从而导致其死亡。目前使用的有两大类，即干热灭菌和湿热灭菌。

　　干热灭菌最常见的例子是用火焰灭菌。这是最彻底的灭菌方法，但是并不是随时随处可以应用的。我们常常用这种方法来处理病死的家畜家禽。实验室或发酵车间也经常用火焰灭菌。在要求灭菌后的器具干燥的情况下，通常也采用干热灭菌。例如用电烤箱在160℃左右保持2小时，可以将玻璃或金属器皿完全灭菌。

　　湿热灭菌的方法更多。因为在有水或水蒸汽存在的条件下，细胞内部更易遭受伤害，所以可以在较低的温度和较短的时间内达到灭菌的目的。微生物的营养细胞比较容易被杀死，而芽孢则较耐热。下表列出了在湿热条件下杀灭几类主要微生物所需要的温度和时间。

 

微生物	营养细胞	孢子或芽孢
酵母菌	50-60℃，5分钟	70-80℃，5分钟
霉菌	62℃，30分钟	80℃，30分钟
细菌（中温细菌）	50-70℃，10分钟	2-800分钟，100℃；或120℃，05-12分
病毒	60℃，30分钟

 

 

目前采用的湿热灭菌方法有：

　　1）常压法。其中主要有巴斯德消毒法、煮沸消毒法和间歇灭菌法。前两种条件比较温和，所以不能消灭全部微生物，因此是消毒。

　　巴斯德消毒法最早是法国伟大的微生物学家巴斯德用来处理葡萄酒防止其变酸的办法，所以一直用巴斯德的名字命名。这种方法目前仍然大量使用在食品行业，用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等的消毒。消毒后可以保持食品的原有风味。这种方法具体实施时对温度和作用时间的控制要看处理对象决定。例如目前对牛奶的消毒就有低温维持法和高温瞬时法两种，前者是在63℃维持30分钟，后者则是在72℃处理15秒。

　　煮沸消毒法是在常压下通过煮沸来达到消毒目的。例如在非高原地区将水加热到100℃来消毒饮用水。

　　间歇灭菌法又叫分段灭菌法。在没有高压灭菌设备，灭菌对象又比较稳定的情况下，可以达到基本完全灭菌的目的。一般用于液体的灭菌。方法是将要灭菌的液体在90-100℃加热15分钟以上，使营养细胞死亡，然后将其冷却到30℃，并保持这个温度过夜，这时，灭菌样品中没有被杀死的芽孢因为温度适合而萌发成营养细胞，到第二天再把该液体在90-100℃加热15分钟以上。如此重复3次，即可以将液体中的微生物全部杀死，达到灭菌的目的。某些做微生物学实验的培养基，因为某些成分在120℃左右容易破坏，就可以采用间歇灭菌法。

　　2）加压法。又称加压蒸汽灭菌法，因为在超过大气压的密闭容器中，水蒸汽的温度可以大于100℃，更有利于杀死微生物。例如用加压灭菌锅（亦可用家用压力锅），当锅内压力达到每平方厘米1千克时，水蒸汽的温度可以达到121℃，一般微生物的营养细胞和芽孢在这个温度下通常在15-30分钟内即可彻底被杀死。加压蒸汽灭菌法是微生物学研究和微生物应用产业中采用得最多的灭菌方法，从19世纪沿用至今。随着灭菌器具的不断改进，效率也越来越高。

 

 

冷冻和加热的不同之处是这种方法不是简单地破坏微生物，而是抑制微生物的生长和繁殖。低温法抑菌在食品工业中采用最多，因为在低温下（4℃左右）大多数病原菌都不能生长，在微生物学实验和微生物工业中，这种方法不能起到灭菌的作用。一般在-20℃微生物就不会生长了，因为此时没有液态的水供微生物活动之用，也有些微生物可以被冰杀死，因为冰会破坏微生物细胞膜

 

有些需要灭菌的材料不能受热，例如许多维生素溶液。因此，许多液体可以用过滤法来灭菌。过滤法不是将微生物杀死，而是把它们排除出去。目前过滤除菌采用两类器具，一类叫深层滤器，例如用烧结玻璃、不上釉的陶瓷颗粒或石棉压成的滤板等：另一类是滤膜。深层滤器已经使用了100年以上，现在有逐渐被滤膜取代的趋势，但因为大量沉淀物容易堵塞滤膜，所以一般先用深层滤器除去大的颗粒。

　　滤膜一般由醋酸纤维素、硝酸纤维素、多聚碳酸酯、聚偏氟乙烯等合成纤维材料制成。滤膜的孔径一般为0.2微米，它可以滤除绝大多数微生物的营养细胞。过滤法的最大缺点是不能滤除病毒。

　　我们来看一下滤膜灭菌是如何工作的。如左图所示，在一个漏斗形容器上部放置数片滤膜。右图是整个过滤系统。待除菌的液体装在三角瓶中（1），用蠕动泵（2）将液体抽到过滤器（3）内，滤过的液体进入事先灭菌的瓶子中。

如果是灭菌少量液体，可以采用一种简单的的滤器。

　　过滤法用途广泛，除在饮料、药物生产中使用外，空气也常常用过滤法除菌。我们通常做微生物学实验时灭过菌的容器一般用棉花塞堵在出口处，实际上就是过滤除去空气中的微生物，使进入容器的空气中没有微生物污染。微生物学实验室使用的超净台也是用过滤法除菌。

 

辐射灭菌是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。用于灭菌的电磁波有微波、紫外线（UV）、X射线和γ射线等。它们都能通过特定的方式控制微生物生长或杀死微生物。例如微波可以通过热产生杀死微生物的作用；紫外线使DNA分子中相邻的嘧啶形成嘧啶二聚体，抑制DNA复制与转录等功能，杀死微生物；X射线和γ射线能使其它物质氧化或产生自由基（OH·H）再作用于生物分子，或者直接作用于生物分子，打断氢键、使双键氧化、破坏环状结构或使某些分子聚合等方式，破坏和改变生物大分子的结构，从而抑制或杀死微生物。即使可见光在长时间照射后，也能损害微生物或杀死它们，因为所有光合生物含有叶绿素（或细菌叶绿素）、细胞色素、黄素蛋白等光敏感色素，它吸收光能变成激发态或被活化，并将吸收的能量转移到氧，产生氧自由基作用于细胞，导致机体突变或死亡。辐射灭菌的效果受其它因子制约，例如光可使嘧啶二聚体解体，降低紫外线作用效果，氧可提高X射线或γ射线作用效果等。

　　实行辐射灭菌的装置包括微波炉、紫外光灯、阴极射线管、X射线发生器、放射性核素等。商业上用于大量物品灭菌使用的放射性源是钴-60和铯-137，它们发射出γ射线，相对而言比较廉价。辐射灭菌用途很广，例如医疗器械和用具（如注射器灯）、食品、实验室的许多塑料制品和多种培养基都是用这种方法灭菌。