基因工程菌株的培养与观察

 

大肠杆菌是含有长约3000Kb的环状染色体的棒状细菌，它能在仅含碳水化合物（如葡萄糖，提供碳源和能量）和提供氮、磷、微量元素的无机盐的极限培养基上快速生长。如果用含氨基酸、核苷酸前体、维生素以及其它一些细菌不能合成的代谢成分的丰富培养基来培养，那么大肠杆菌会生长的更快。大多数应用于DNA重组技术的细菌是大肠杆菌K-12株的衍生菌株。

 

当大肠杆菌在液体培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个生长滞后期。在丰富培养基中，它能在20-30min内复制一代，这种指数生长相称之为对数期。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值。在通常的实验室培养中，在这一时期的细胞密度一般为1*10⁹—2*10⁹ml，细胞停止迅速分裂。这就是细菌生长的饱和期，而所谓的新鲜饱和即指当培养液中细胞密度刚到达这一水平。

 

培养特征是指微生物在培养基上所表现的群体形态和生长情况。细菌培养特征的常规检验包括平面上的菌落特征，液体培养时的生长特征以及斜面培养上的菌苔特征。菌落是个体微生物在固体培养基上生长繁殖成的肉眼可见的群落。在一定的培养条件下，不同的细菌形成的菌落形状是不一样的。

 

超净工作台酒精灯无菌培养皿及试管 接种环 无菌牙签 涂布棒DH5α菌株

LB液体培养基：每升含10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCL、1mL 1M NaOH

LB固体培养基：每升含10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCL、1mL 1M NaOH、15g琼脂糖

（一）在固体培养基中培养

将已熔化的LB固体培养基冷凉到50℃左右（即热而不烫手），按无菌操作倒入无菌培养皿内，冷却凝固成平板，将涂布棒的三角部分浸没于酒精中，取出后再通过灯焰，点燃其上的乙醇，待涂布棒上的火焰熄灭后，将其触碰无菌琼脂平板的表面使其冷却。然后，取少许菌液（100uL）滴在平板上，用涂布棒作圆周运动将菌液涂布均匀，待平板干后于37℃倒置培养过夜。待菌落长出后，观察菌落特征

（二）在液体培养基中培养

取5mL液体培养基加入一支无菌试管中，用无菌牙签挑一个单菌落浸没于培养液中并轻轻振动，使待接种的细菌分散在培养液中，盖好试管，在摇床上以60r/min于37℃培养至饱和（约6h），观察液体培养物是否混浊。利用分光光度计监测，按每0.1 OD值大约相当于10⁸细胞/mL计算细菌浓度。