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细菌的转化与平板筛选



录入时间:2011-7-11 14:19:59 来源:互联网

 
[实验原理]
 感受态是指细菌处于容易吸收外源DNA的状态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导人细菌的过程。其原理是细菌处于0℃,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热击处理,促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型(如Ampr等)得到表达,然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。
 
重组质粒转化宿主细胞后,还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其编码α肽链的DNA序列,此结构称为lacZ'基因。lacZ'基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段(146个氨基酸)。任何携带着lacZ'基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后,便会产生出有功能活性的半乳糖苷酶,在IPTG(异丙基β—D—硫代半乳糖苷)诱导后,在含有Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷)的培养基平板上形成蓝色菌落(半乳糖苷酶能将无色的化合物Xgal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝)。而当有外源DNA片段插入到位于lacZ'中的多克隆位点后,就会破坏α肽链的阅读框,从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽,而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶,也就不能分解Xgal而显蓝色,因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。
 
[仪器、材料与试剂]
(一) 仪器和材料
  超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温箱、恒温水浴、离心管、试管、培养皿、锥形瓶、接种针、玻璃涂棒、酒精灯、镊子、牙签、大肠杆菌DH5a 、质粒
 
(二) 试剂
0.1mol/L CaCl2溶液 LB液体培养基 LB固体培养基 
氨苄青霉素(Amp):用无菌水配制成100mg/mL溶液,置—20℃冰箱保存。
Xgal:将Xgal溶于二甲基甲酰胺,配成20mg/mL,不需过滤灭菌,分装小包装,避光贮存于-20℃。
IPTG:取2g IPTG溶于8mL双蒸水中,再用双蒸水补至10mL,用0.22um滤膜过滤除菌,每份1mL,贮存于-20℃。
 
[实验步骤]
(一) 制备感受态细胞
1、吸取15µl E.coil菌液,接种于20ml LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜,待OD600=0.5左右将该菌悬液以1:50接种量转于50ml LB液体培养基中,37℃振荡扩大培养,当培养液开始出现混浊后,每隔20-30min测一次OD600,至OD600=0.6左右,停止培养。
2、培养液转入离心管中,在冰浴10min,4℃下5000rpm离心10min。
3、弃上清液,用4ml冰预冷的0.1M CaCl2溶液轻轻悬浮菌体至均匀,冰上放置30min。
4、4℃下5000rpm离心6min。
5、弃上清液,用2ml冰预冷的0.1M CaCl2溶液轻轻悬浮菌体至均匀,冰上放置片刻后即制成感受态细胞悬液。
6、以上制好的感受态细胞悬液可在冰上放置,24小时内直接用于转化实验,也可加入15%高压灭菌过的甘油,混匀后,分装于1.5ml离心管中,每管100µ l感受态细胞悬液,置-70℃条件下保存。.
(二) 质粒DNA转化大肠杆菌
1、取100µl摇匀后的感受态细胞悬浮液(如是冷冻保存液,则需化冻后马上进行下面的操作),加入5µl连接产物,轻轻摇匀,冰上放置30min后,于42 IPTG水浴中保温90s,然后迅速在冰上冷却2min。
2、加入900µl LB液体培养基,则总体积约1ml,混匀于37℃振荡培养90分钟使受体菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性Ampr
 3、在预制的LB琼脂平板上,加40uL 20mg/mL的Xgal和4uL 200mg/mL的IPTG溶液,并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却),均匀涂布于琼脂凝胶表面,37℃倒置吸收。
4、将恢复培养的菌体4000rpm离心5min,移去上层900µl LB培养基,用余下的100µl重悬菌体至均匀。
(四) α互补现象的检查
将重悬菌体均匀涂布于含X-gal+IPTG+氨苄青霉素的LB平板上,37℃倒置培养12—24h,出现菌落。其中白色菌落从理论上讲为重组克隆。
如果进一步验证,可挑取多个白色菌落分别接种到1ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃振荡培养6-8h,然后提取质粒酶切验证,或进行菌落PCR扩增鉴定。

 

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