大肠杆菌感受态细胞的制备

 

感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl₂等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl₂ 法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl₂法为使用更广泛。

 

大肠杆菌 E.coli DH5α，100ml三角瓶，1.5ml 离心管(又称eppendorf管), 离心管架，1000 ul 、200ul枪头，大量冰块，

 

微量移液器(200μl,1000μl)，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，恒温摇床、冷冻离心机, 超净工作台, 紫外光度计，双蒸水器，冰箱等。

 

1、LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10 g，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调pH至7.5, 加水至总体积1升，高压下蒸气灭菌15分钟。

2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。

3、高压灭菌的0.1mo1／L CaCl₂：母液1M CaCl₂147 g CaCl₂ 2H₂O，加水到1L

4、高压灭菌过的30％甘油

 

大肠杆菌感受态细胞的制备

（1） （已预先准备好）从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落（超净工作台操作），接种于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1：100～1：50转接于20ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养；

（2） 取培养液1.5ml转入微量离心管中，在冰上冷却10min，于4℃，5000r／min离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）。

（3） 倒净上清培养液，用1ml冰冷的0.1mo1／L CaCl₂溶液轻轻悬浮细胞，冰浴，0～4℃，5000r／min离心10min；

（4） 弃去上清液，加入500µl冰冷的0.1mo1／L CaCl₂溶液，小心悬浮细胞。0～4℃，5000r／min离心10min；

（5） 弃去上清液，加入100µl冰冷的0.1mo1／L CaCl₂溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；

（6） 制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后在超净工作台分装到Eppendorf微量离心管中，液氮速冻后，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。