细菌培养及CaCl2法制备感受态细胞

 

实验目的： 

明确培养基的配制原理；通过对LB培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤；掌握细菌的接种、培养的无菌操作方法和步骤。 

 

实验原理： 

重组DNA分子（质粒、噬菌体、粘性质粒）必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。 

大肠杆菌与其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此。 

 

菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂菌。此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。 

 

常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等保护剂。目前比较常用的甘油低温保存法(-70~-196)℃，由于在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。在0~-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。因此，为了避免0~-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌。甘油的使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后贮存于-70℃或液氮中。复苏后细菌仍能生长，活力不受任何影响。 

 

培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质，用以培养或分离各种微生物。因此，营养基质应当有微生物所能利用的营养成分（包括碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素）和水。按培养基的物理状态分液体培养基和固体培养基。固体培养基是在液体培养基中加入凝固剂即为固体培养基。实验用的凝固剂有琼脂、明胶和硅胶，后者用于配制自养微生物的固体培养基。对其他多数微生物来讲，以琼脂最为合适，一般加入1.5~2.5%即可凝固成固体。此培养基可供分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等用。液体培养基是没有加琼脂，配好后成液体状态培养基。常用于生理代谢的研究和工业发酵等。 

 

LB（Luria-Bertani）培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。 

 

实验材料： 

[1].大肠杆菌菌株：DH5α 

[2].酵母提取物（Yeast extract） 

[3].蛋白胨（Tryptone） 

[4].NaCl 

[5].琼脂 (agar) 

[6].1M NaOH 

[7].1M HCl 

[8].0.1M CaCl2：在100ml纯水中溶解2.8gCaCl2.6H2O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成10ml小份，-20℃冻存。 

[9].37℃培养箱、试管，三角烧瓶，烧杯，培养皿（9cm），量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH5.5~9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳等。 

 

实验步骤： 

1、LB培养基的准备 

[1].称量：准确地称取酵母提取物5g、蛋白胨10g、NaCl 10g，放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。 

[2].溶化：加入800ml ddH2O，用磁力搅拌子搅拌溶解。 

[3].调pH：先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用1M NaOH调节pH达7.0。反之，则用1M HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。pH调节好之后，用ddH2O定容到1000ml。如果要配制固体LB培养基，1000ml液体培养基加入15 g琼脂。 

[4].分装：按实验要求，将液体培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。 

[5].加塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 

[6].包扎：加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。 

[7].灭菌：将上述培养基以0.1~0.165 MPa (120~130)℃高压蒸汽灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。 

[8].搁置斜面：将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。