由于细菌感染而致病的各种标本及带菌者所需检查的各种标本，往往并非单一的细菌，而混有其它非致病菌（人体正常菌群）。因此当对此标本须作出细菌鉴定时，就必须从标本中分离出致病菌，称为细菌分离培养技术。另外，对已得到可疑病菌进行细菌鉴定及菌种保存等培养，称为纯培养接种技术。
（一）平板划线接种法（又称分离培养法）
平板划线接种法为最常用的分离培养细菌的方法，通过平板划线后，可使细菌分散生长，形成单个菌落，有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌。平板分离划线的方法较多，其中以分区划线法与曲线划线法较为常用。其目的都要使细菌呈现单个菌落生长，便于同杂菌菌落鉴别。现只介绍分区划线法。
1、右手持接种环，经火焰灭菌，待凉后，挑取大肠杆菌（或葡萄球菌）培养物少许。
2、左手斜持琼脂平板，皿盖留在桌上，于火焰近处将菌涂于琼脂平板上端，来回划线，涂成薄膜（约占平板总表面积的 1/10），划线时接种环与平板表面成30~40º角，轻轻接触，以腕力在平板表面行轻快地滑移动作，接种环不应划破培养基表面。
3、烧灼接种环，杀灭环上残留细菌，待冷（是否冷却，可先在培养基边缘处试触，若琼脂溶化，表示未凉，稍等再试），从薄膜处取菌作连续平行划线，约占平板表面1/5左右，再次烧灼接种环，等三次平行划线……以同样方法作第四次，第五次划线，将平板表面划完。
4、划线完毕，盖上平皿盖，底面向上，用标签或腊笔注明菌名检验号码，接种者信息等，置37℃孵育培养24小时后观察结果。
（二）纯培养细菌接种法（斜面培养基接种法：用于培养，保存菌种及其它实验用）
1、取一支斜面培养基及一支纯菌种管，并排倾斜放在左手四指中拇指压住并以手掌支住两试管底部。右手将白金环于火焰上灭菌、冷却。并拔起两试管的棉塞。（勿放置桌上，如棉塞太紧时应预先松动）。
2、试管口部于火焰上往返通过2~3次灭菌，将灭菌白金环伸入有菌试管中，取少量细菌（一般应从斜面底部沾取），然后小心移至准备接种的试管中。
3、接种方法是自管底向上连续平划线，若以保存菌为目的时可自管底上划一粗直线即可。
4、取出接种环，将试管上部再经火焰灭菌，塞好棉塞，接种环灭菌后放回原处。
5、若自平皿培养物中取菌时，只应沾取一个单个菌落。
6、接种菌应作好标记，标明菌种名称，日期等，置37℃温箱中培养，次日观察结果。
液体培养基接种法：用于增菌及鉴定细菌生长特点，如表面生长，沉淀生长，均匀混浊生长等。操作技术基本与上法相同，只是接种时应将沾菌之接种环沿接近液体表面之管内壁轻轻摩擦（勿用力振荡）使细菌混入培养基内，置37℃温箱中培养，次日观察结果。
（三）半固体培养基穿刺培养法
用于保存菌种及间接观察细菌之动力（无动力之细菌仅沿穿刺线生长，清晰可见；有动力的细菌使培养基呈现混浊样，穿刺线甚至难以看出）。
用无菌操作技术，灭菌穿刺针沾取细菌后，垂直刺入半固体培养基中央直达近管底处，再沿原穿刺线抽出即可，置37℃温箱培养，次日观察结果。
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