细菌的人工培养方法

 

了解常用的液体、固体和半固体培养基的成分、制备方法和用途。初步掌握各种培养基接种技术；观察细菌在培养基中的生长现象；认识菌落、菌苔。

 

培养基是用人工方法将微生物生长繁殖所需的多种营养物质调配在一起，形成的一种营养物质的混合物，用以分离、传代和培养细菌。按培养基的用途分为基础（普通）培养基、营养培养基、鉴别培养基，选择培养基、厌氧培养基等。按培养基的物理形状又分为液体、固体和半固体三种。

 

三角烧瓶、天平、试管、平皿、高压消毒灭菌器。

 

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究目的不同，所以培养基的种类很多。但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、无机盐、生长因子等。

 

不同的微生物在固体、半固体和液体培养基中能表现出各自特有的培养特征，这些特征可以作为不同种类微生物的鉴别特征之一。了解它们的培养特征、掌握其生长规律对识别、控制和利用微生物具有重要价值。

 

（一）常用培养基的制备

1、普通液体培养基

(1)将新鲜的精牛肉除去脂肪和筋膜制成肉馅，取500克牛肉馅加l000ml蒸馏水，置4℃冰箱浸泡过夜，使牛肉中的水溶性营养物质充分浸出。

(2)次日将浸泡过夜的牛肉馅加热煮沸30分钟，放凉，使残余的脂肪凝固，然后用纱布和滤纸过滤，最后将滤液补足为原量，此种液体为牛肉浸汁。

(3)取1 000ml牛肉浸汁加蛋白胨10克，氯化钠5克加热溶解，冷至50℃左右时用氢氧化钠调整pH至7．6，再煮沸10分钟(因牛肉浸汁中部分碳水化合物，经加热破坏产酸，影响pH；产生多磷酸盐，培养基不澄清)待冷却后，再调整pH至7．6，然后以滤纸过滤，滤液必须澄清，此种液体称为肉汤培养基。

(4)将肉汤培养基分装于试管或三角烧瓶中，塞好试管和瓶塞，包装好后，用15磅(121℃)蒸气15～30分钟灭菌。待冷后，置4℃冰箱中保存备用。牛肉汤培养基主要用于纯种细菌的培养和增菌，也是其它培养基的基础。

 

2、普通琼脂培养基

(1)取100ml牛肉汤加入2～3克琼脂(根据琼脂凝固程度决定)。

(2)加热100℃溶化后，趁热调整pH为7．4。

(3)分装于试管或三角烧瓶中，塞好试管和瓶塞，包装好后，用15磅灭菌15～30分钟。

(4)待培养基冷至50℃左右无菌操作倒入无菌试管，趁热将试管斜置，冷凝后即为琼脂斜面培养基；将培养基倒入无菌平皿，平放，待凝固后即为普通琼脂平板。置4℃冰箱中保存备用。琼脂斜面培养基主要用于纯种细菌的培养，琼脂（琼脂血）平板主要用于杂种细菌的分离和药物敏感性试验等。

 

3、半固体培养基

其制备方法基本上与普通琼脂培养基相同，只将琼脂的用量改为0．3％～0.5％即可。通常分装于试管内占试管体积的1/3的量，高压灭菌后直立，使其凝固成高层。半固体培养基可供检查细菌动力和保存菌种之用。

 

4、血液琼脂培养基： 

(1)将制好的普通琼脂培养基高压灭菌后。

(2)待冷至56℃左右时，加入5％～10％脱纤维的无菌的绵羊的血液（也可用家兔血和人血），混匀(注意勿产生气泡)，分别倒人灭菌试管或平皿中，即制成血琼脂斜面或血液琼脂平板。置4℃冰箱备用，血液琼脂平板是咽拭子最常用的培养基。

 

5、蛋白胨水培养基：

取100ml蒸馏水，加入蛋白胨1克和氯化钠0．5克，加热溶解，待冷却后，调整pH为7．6，分装于试管或三角烧瓶中，15磅灭菌15～30分钟，待冷，置4℃冰箱中保存。蛋白胨水培养基常用于制备单糖发酵管或用于检查细菌的吲哚试验等。

 

（二）细菌培养基的接种方法

1、分离培养法(平板划线法)

 

（1）分区划线：

①右手持接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌，待冷（稍待约5～10秒钟），取细菌培养物（或病人材料）少许。

②左手持琼脂平板底部拇指稍顶开平皿盖（接种环能进入方便操作即可），并靠近酒精灯火焰(火焰周围直径10cm左右范围空气中细菌含量少)附近操作，以免空气中杂菌落入。右手握持沾菌的接种环在琼脂平板边缘上端来回划线涂成菌膜，菌膜占总面积的1/10，划线时接种环的面与平板面成45度角轻轻接触，以手腕的力在平皿表面做轻轻的滑动，划线要求密集平行，充分利用平板表面。

③烧灼接种环，杀灭环上残留的细菌，待接种环冷却后将接种环通过菌膜处作连续划线，以占平皿面积的1/5，为一区划线。

④左手旋转平皿90度左右，烧灼接种环，杀灭环上残留的细菌，待接种环冷却后，继续用接种环通过一区2～3次连续划线占平皿面积的另1/5，为第二区划线。

⑤如此重复操作3～5次。

将培养皿放置37℃温箱内，翻转培养(即皿底在上，盖在下)。经37℃，24小时培养后取出，观察琼脂平板表面生长的各种菌落，注意其大小、形状、边缘、表面、透明度、颜色等性状。在血琼脂平板上，尚可观察菌落四周有无溶血现象。

 

(2)连续划线法：

这种方法主要适应于熟练技术人员。以无菌操作取标本涂抹于平板边缘的上端成菌膜，占平板面积的1/10，酒精灯火焰上烧灼接种环法灭菌，待冷却后重复涂抹菌膜一部分，再向下连续划线至平板底部，经37℃培养18～24小时后观察生长情况。

 

2、斜面培养基接种方法

①左手的拇指、食指、中指、无名指分别持握菌种管与接种管，将两管并列，略倾斜斜面部均向上，右手分别转动两管棉塞，以便接种时易于拔取。

②右手执持接种环(姿势与握铅笔相似)，接种环和环柄的金属部分酒精灯烧灼灭菌。

③以右手手掌与小指、小指与无名指分别拔取并夹持两管棉塞，将两管管口迅速通过酒精灯火焰灭菌。

④将灭菌并已冷却的接种环伸入菌种管中，从斜面上刮取菌苔少许，退出菌种管，再伸进待接种的培养基管，自斜面底部轻轻向上划一条直线，再次深入底部在琼脂表面轻轻的蛇形划线。沾菌的接种环，进出试管时，均不应触及试管内壁。

⑤接种完毕，接种环酒精等火焰灭菌，将两管管口迅速通过酒精灯火焰2～3次灭菌，塞回棉塞，标记培养管。经37℃孵育18～24小时后观察生长情况。

 

3、液体培养基接种法

①握持菌种管及待接种即肉汤管的方法同斜面培养基接种法。

②接种环灭菌冷却后，伸入菌种管刮取少量菌苔退出菌种管，再伸人肉汤管，在接近液面的管壁上轻轻研磨，并蘸取少许肉汤调和，使菌混合于肉汤中。