细菌的局限性转导实验原理、材料和实验步骤

 

 

转导是由噬菌体为媒介将一个细胞的遗传物质转移给另一个细胞的过程。随着分子遗传学的发展，转导已成为基因精细结构分析的常用方法。转导可分为局限性转导和普遍性转导二大类。

本实验试图用局限性转导为例，用噬菌体（λ）专一性转导半乳糖发酵基因的现象来说明转导的基本原理。并初步掌握转导实验的基本方法。

用E Coli k₁₂ (λ) gal 作为供体菌，此菌带有原噬菌体（λ）。控制半乳糖发酵的基因在细菌染色体上和（λ）紧密连锁。当此菌体受紫外光诱导后，原噬菌体被释放出来，其中有一定比例的噬菌体带有邻近的半乳糖发酵基因。这种噬菌体称λdg，这种噬菌体在感染另一不能发酵半乳糖的菌体时（即受菌体）就有可能使其转变成为能发酵半乳糖的菌体。整个过程可以下图表示：

                K₁₂（λ）gal⁺（供体菌）

                         ↓UV

                       λgal⁺

                         ↓

K₁₂ S gal^-（受体菌）→ K₁₂ S gal^-/ (λ) gal⁺（转导子）

上述转导方式产生转导子的频率是很低的，称低频转导。我们选用K₁₂（λ/λgal）双重溶源菌作供体菌，它经U、V诱导裂解后，可含有大量的带gal⁺基因的转导颗粒，故转导频率很高，称高频转导。

 

大肠杆菌（E Coli）K₁₂（λ）gal⁺，带有原噬菌体（λ）和缺陷噬菌体（λdg）能发酵半乳糖，作为供体菌。

K₁₂ S gal^-，不带噬菌体，不能发酵半乳糖，对噬菌体（λ）敏感。作为受体菌及测定噬菌体（λ）效价的指示菌。

 

1.用具：6cm培养皿                1套

       9cm培养皿                6套

        1.5ml离心管              5支

        离心管                    2支

 

2.培养基

（1）       LB液体培养基

（2）       加倍肉汤培养液2ml成分同LB培养液，浓度加倍。

（3）       半乳糖EMB培养基：伊红（Y）0.4克、美兰0.06克、半乳糖10克、蛋白胨10克、K₂HPO₄ 2克、蒸馏水、1000ml、pH 7.0-7.2

（4）       磷酸缓冲液：5ml(用1×A)

KH₂PO₄      1.5g          

K₂HPO₄      9g                                 

 蒸馏水     1000ml   pH7.0

 

3.药品：氯仿0.2ml

 

1.噬菌体的诱导和裂解液的制备

第一天：傍晚，从供体菌斜面挑取一环接种于5ml的LB培养液中，37℃培养过夜。

第二天：吸取1ml接种于装有5ml LB培养液的离心管中，续培养3小时。（另吸取0.1ml，涂一皿，作供体菌对照）

供体菌培养物经3000转/分离心10分钟弃去上清液，加4ml磷酸缓冲液制备成菌悬液。

吸取2ml到直径6cm的培养皿中，经紫外线处理（15瓦。灯距40厘米），打开培养皿盖子照射20秒钟后加入加倍浓度的肉汤2ml，在37℃避光培养2-3小时。

用1ml移液枪把上述培养物转入5ml的离心管中。再加0.2ml氯仿（4-5滴）。剧烈振荡半分钟，静止5分钟，以4000转/分离心15分钟。小心把上清液用无菌滴管转称到另一试管，此即噬菌体（λ）的裂解液。

2.受体菌的制备。

第一天：傍晚，从受体菌斜面挑取一环接种于5ml LB培养液中，37℃培养过夜。

第二天：吸取1ml接种于装有5ml LB培养液的离心管中，继续培养3小时。

3.转导实验（点滴法）：

取倒好的EMB培养基平板2只，在皿底用标记笔按下图中的样子画好取一满环受体菌，涂出一条菌带，共涂两条。37℃培养1.5小时，取出平板，在两个圆圈和四个方格处，各加一环噬菌体裂解液，培养2天，观察结果。

4.转导频率的测定：

取受体菌0.5ml于离心管中，在37℃预热数分钟后，加0.5ml噬菌体裂解液，摇匀，置37℃水浴中保温15分钟后，稀释到10^-3，取10^-1、10^-2和10^-3的稀释液0.1ml在预先倒好的EMB平板上涂布，同时，取受体菌0.1ml涂一皿，作为对照，37℃培养48小时，统计转导子数目算出转导频率。

 

1.点滴法结果

 

2.转导频率测定