噬菌体的分离和鉴定

 

部分菌株对应的噬菌体分离过程步骤：

 

(1) 以新鲜鸽粪4g 加入100ml 普通液体培养基内，放入37 ℃温箱培养24h。

(2) 次日从中取出10ml70 ℃加热30min ,离心2000r/ 10min ,上清液用滤器过滤后保存于4 ℃冰箱备用。

(3) 在普通琼脂平板底面分别注明1、2、3 号。

(4)在1 号平板接种事先培养好的6h 幼龄菌乙型副伤寒杆菌一接种环；2 号平板接种幼龄菌福氏痢疾杆菌一接种环;3 号平板接种幼龄菌大肠杆菌一接种环,各平板的细菌密集涂布于琼脂平板表面。

(5) 再用无菌接种环取鸽粪培养滤液一接种环,分别滴加于3 个已接种细菌的平板中央,放入37 ℃温箱孵育24h。

 

先后从农贸市场采集各类海产品158 份, 分别用15 株假单胞菌作指示菌, 共分离到27 株噬菌体, 分离率为17.11%。检出的噬菌体经实验室反复增殖、裂解等鉴定试验, 从中精选出9 株裂解力较强, 生物学性状较典型的噬菌体, 分别用双层琼脂法作单斑纯化培养。这9 株噬菌体的噬菌斑圆形透明, 边缘有的整齐有的稍不整齐, 直径均在110～210 mm; 在电镜下的形态可见有头部和尾部, 均呈蝌蚪状; 增殖液的效价均可达10829pfu/m l。

 

在有指示菌的双层琼脂平板上逐格滴加备用的待检噬菌体液,进行交叉裂解试验,即每一株菌均被所有待检噬菌体液逐一滴加。待平皿干后,置37 ℃培养过夜。若有相应的噬菌体存在,即可在平皿上出现裂解噬斑(即为阳性) ,不裂解者为阴性。对分离到的每一噬菌体均经单噬斑分离纯化3 次以上,增殖后置4 ℃冰箱保存。

 

4.1 　材料与方法

4.2 　菌株

噬菌体分离所用的指示菌为河流弧菌29301 , 用于宿主范围测定的菌株共8 株: 河流弧菌Ⅱ9302 , 9401 , 9402 , 9403 , 9404 , 9501 , 9502 及9503 均为本实验室保存。

4.3 　培养基

培养河流弧菌及噬菌体分离所用的培养基为海水胰蛋白胨培养基。其中: 胰蛋白胨10g , 酵母膏5g , 陈海水1000mL , pH712～715 。制作底层培养基时, 加琼脂15g ; 制作上层培养基时, 加琼脂7g。

4.4 　样品的采集和噬菌体的分离

 

1996、1997 年两个夏季, 从大连市水产养殖公司所属皱纹盘鲍养殖区的不同地点采集海水和海底淤积物, 每次采集10 个样品, 每个样品为同一地点采集的3 份不同水样或海底淤积物混合而成。为了分离噬菌体, 取海底淤积物100g , 加入等量海水, 充分振荡30min , 静置, 过滤, 取上清液100mL 加入50mL 3 倍浓缩的海水胰蛋白胨及2mL 浓度为1012个/ mL 的河流弧菌2 菌悬液, 30 ℃培养过夜, 以促进噬菌体的增殖。海水样品过滤后按上述方法直接富集。经富集后的培养液加入1/ 10 的氯仿, 30 ℃静止1h , 于4000r/ min 离心20min , 取上清液用于双层琼脂法分离噬菌体。为了纯化噬菌体, 挑取单斑连续传代, 重复进行5 次以上, 选择平板上所有噬菌斑形态和大小基本一致的材料,进行下一步研究。