组织培养技术

 

所谓组织培养就是将植物的各类器官组织作为外植体,接种于人工配制的培养基上,并配合一定的营养、激素、温度、光照等条件,以无菌培养方式增殖的一种生物技术. 植物组织培养是在无菌条件下，将植物体的一个器官，如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等，或一种组织，如形成层、花药组织、胚乳、皮层等，或单个细胞，如体细胞、生殖细胞等，或胚胎，如成熟和未成熟的胚，或原生质体，如脱壁后仍具有生活力的原生质体，从植物体取出后，放在洁净容器内的人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，使它们得以继续生存或发展，诱发产生愈伤组织、潜伏芽、不定芽、不定根等，或长成完整的植株，统称为植物组织培养。由于是在试管内培养，而且培养的是脱离植物母体的培养物，因此也称离体培养和试管培养。根据外植体来源和培养对象的不同，又分为植株培养、胚胎培养、器官培养、组织培养、原生质体培养等。植物组织培养技术是近代生物科学发展起来的一门新技术，是生物技术(即生物工程)的主要组成部分，是在超净的组培室中快繁脱毒即工厂化的栽培室中进行的规模生产。自哈布兰特(G.Haberlandt) 1902年提出植物细胞的全能性，即每个植物的本细胞或性细胞都具有该植物的全套遗传基因，因此在一定培养条件下每个细胞都可发育成一个与母体一样的植株。这个概念虽然在上世纪初已经提出，但在当时的技术条件下，在实践上并没做到。经过80多年来无数科学家的努力，组织培养技术得到不断改进，技术趋于完善、成熟，目前细胞的全能性不但在理论上完全被证实，而且为组织培养在实践上的应用奠定了基础。植物组织培养已遍地开花，在世界各地进展很快。培养的材料有茎尖、根尖、花粉、花药、叶原基、愈伤组织、细胞等，已经培养成功的植物有近千种。

 

1、花卉组织培养对实验室及设备的要求 

　　花卉组织培养是在人工控制的条件下培养花卉，是一种花卉现代工厂化生产新技术，所以其对实验室及设备有一定的要求。 

　　实验室方面 

　　①化学实验室：主要承担配制培养基的任务。要求具有各种化学药品试剂、各种玻璃器皿、称量天平等。 

　　②洗涤室：主要进行玻璃器皿的洗涤，要求有自来水装置，同时有烘箱，以便洗后烘干。 

　　③灭菌室：主要进行培养基和用具的消毒。要有高压灭菌锅，具有水源和电源。 

　　④接种室：是花卉材料分离、消毒接种和转移的场所。要求密闭、清洁、整齐、装有紫外灯，能随时灭菌。有的也可用接种箱或超净工作台代替。 

　　⑤培养室：是花卉材料培养生长的地方。要求清洁，保温好，室温均匀一致，并有绝热、防火性能。 

　　设备方面 

　　①天平：供配制培养基时称量药品和激素用。大量元素用普通天平；微量元素和激素用分析天平。 

　　② 酸度计：测定培养基的pH用。 

　　③高压灭菌锅：是供培养基和器械用具灭菌用。 

　　④烘箱：洗净的玻璃器皿干燥灭菌用。 

　　⑤蒸馏水制造装置：得到纯净水供培养用。 

　　⑥冰箱：供贮放母液和植物材料用。 

　　⑦接种箱或超净工作台：为植物材料接种或转移的操作场所。 

　　⑧空调机：控制室温用。

 

3、花卉组织培养对培养基的要求 

　　培养基是花卉植物组织培养中十分重要的基质，目前应用的有好多种，但其主要成分大体相同，主要成分是水，其他还有大量元素、微量元素、维生素、生长调节物质、蔗糖和琼脂等。 

花卉组织培养中应用最多的为MS培养基。其组成是在配制1升（1000毫升）培养基时，加硝酸铵1.65克、硝酸钾1.9克、氯化钙0.44克、硫酸镁0.37克、磷酸二氢钾0.17克、碘化钾0.83毫克、硼酸5.2毫克、硫酸镁22.3毫克、硫酸锌3.6毫克、钼酸钠0.25毫克、硫酸铜0.025毫克、氯化钴0.025毫克、硫酸铁27.8毫克、蔗糖30克和琼脂7克。其他生长调节物质要根据花卉的种类和培养目的而确定。MS培养基中大量元素浓度过高，为此常采用1/2、1/4大量元素浓度作培养用，这样生长效果列好。 

　　配制培养基前要准备好三角瓶、试管、烧杯、量筒、吸和等玻璃器皿，预先称好药品。配制时先将琼脂溶化，再加入在水中深解的各种营养元素和蔗糖，然后用氢氧化钠或盐酸调整培养基的pH，一般掌握在5.7左右。以后可分注到养瓶中，盖好瓶盖。培养基配好要经高压灭菌。冷却后放到培养室预培养3天，如没有杂菌污染，才可进行花卉材料的接种。

 

3、花卉组织培养的过程  

　　花卉植物组织培养即无菌培养，也就是要求培养的材料不带有杂菌。从田间或温室等地切取花卉材料时，应选择健壮无病虫母株，取幼嫩、分生能力强的部位，以利生长。 

　　取来的材料虽经选择，外部总还有不少杂菌。为此，接种前应进行表面灭菌。通常先用自来水冲洗十几分钟，有泥的应刷去。冲洗干净后，用70%的酒精浸泡10-15秒钟消毒。接着用无菌水（经高压灭菌的蒸馏水）冲洗两次，再用10%的漂白粉澄清液浸泡20分钟消毒，最后用无菌水冲洗3-4次。带有茸毛不易湿润消毒的材料可加些洗衣粉。上述操作皆应在接种箱或超净工作台等无菌环境条件进行。经过表面灭菌的材料，用无菌滤纸将水吸掉。再用解剖刀切取所需部位，通常几毫米大小，培育无病毒苗则应在1毫米以下，然后用解剖针或枪式镊子将材料接种到培养瓶上培养。工具用完即应在95%酒精中蘸一下，或用火焰消毒法消毒，避免工具带菌造成交叉污染。操作时应穿工作服、戴工作帽，事先洗净手，后再用酒精棉擦试一遍

 

4、花卉组织培养材料的培养和移植

 

　　花卉材料接种后放到培养室培养。培养室是花卉材料培养生长的场所，一般几到十几平方米皆可。高度约2米左右，空间小，可节省控温能源。培养材料放在培养架上培养。培养架可有木材或金属制成，有4-5层，每层高40-50厘米，日光灯装在上方。架长1.2米左右，与40瓦日光灯长一致，宽80-90厘米。每一层可装两支日光灯，这样培养时的照度约为3000勒克斯。培养室的温度大多采取昼夜恒温培养，保持在25℃±2℃，也有采取昼夜变温培养的，夜晚温度可低些，这应根据花卉生长需要而定。每天日光灯照明12-16小时。

 

　　花卉试管苗由于人工提供各方面优越条件，一般生长发育好，根系也多，可往往由于没掌握其特性，造成移栽时成活率不高。这是因为试管苗在瓶中湿度很高的条件下培养，人为提供蔗糖等碳源，花卉材料是处一起异养生活状态，可以说比温室生长的花卉还要娇嫩得多。而突然从瓶中移到土壤让其过自养生活，往往由于变化太剧烈而造成损伤甚至死亡。为此，花卉试管苗开始移出时，仍应罩上玻璃瓶，或盖上薄膜袋（上开几个小孔），1周后去掉。有喷雾条件则更理想。开始7-10天要遮荫，以后逐渐见阳光。移植基质以沙与蛭石各半为好，要排水、通风好，隔一天浇一次营养液。这样逐步锻炼，让其适应环境。2-3周后经驯化锻炼苗即可移至培养土中栽植

 

5组培技术在花卉生产上的应用主要是：

 

a、快速、大量繁殖优良品种

 

组织培养与传统的无性繁殖相比，工作不受季节限制，而且经过组织培养进行无性繁殖具有用材少、速度快等特点，对一些难繁殖的名贵品种花卉及一些短期内大量急需生产的花卉应用很广，如兰花、菊花、唐菖蒲等花卉利用腋芽增生，短期可得到大量植株，非洲紫罗兰可通过叶片，水仙可通过鳞片，诱导产生不定芽，达到大量繁殖的目的。

 

b、花卉的育种

 

在花卉育种上，主要在胚胎培养、单倍体育种、体细胞杂交和植物基因工程等方面应用较多，此外还可采用愈伤组织诱变、花粉培养等多种方法来进行花卉育种。通过组织培养，可缩短育种年限和世代，也有利于基因突变中隐性突变的分离。百合、鸢尾等许多花卉可以进行远缘杂交，由于生理代谢等方面的原因，常使杂种胚早期败育，因而得不到杂种植物。而在试管中进行胚培养，可使其顺利生长，得到远缘杂种。

 

c、花卉的提纯复壮

 

运用组织培养，苗木的复壮过程很明显，对于长期运用无性方法繁殖并开始退化的花卉品种，如康乃馨采用组培方法繁殖，可使个体发育向年轻阶段转化。

 

d、获得无病植株

 

一些用无性繁殖方法来繁衍的花卉种类如康乃馨、菊花、郁金香、唐菖蒲、水仙、百合、鸢尾、大丽花等，靠无性繁殖不能通过种子途径去除病毒，病毒逐代传递积累，危害日趋严重，影响了花卉的观赏效果。而花卉植物0.1～0.5mm大小的生长点区几乎不含或含极少病毒，因为该区无维管束，病毒难以进入，把这个区从植株母体分离培养，得到的基本上是无病毒苗，为获得无病毒植株的重要途径。

 

e、种质资源的保存

 

很多无性繁殖的植物因没有种子，无法长期保存，其种质资源传统上只能在田间种植保存，耗费人力物力，且资源易受人为因素和环境因素影响而丢失。而用组培方法保存，可大大节省人力、物力，并延长保存期，保证种质资源不会突变和流失。

 

6 组织培养技术具有如下特点：

 

繁殖要在严格控制下完成，进行时所需材料少，但繁殖速度快，繁殖系数高。如一年内一个兰花茎尖可繁殖出100万以上的植株；且繁殖周期短，一般30天左右即为一个周期；可全年生产，打破传统“靠天吃饭”的模式，不受季节影响，可按市场需要组织生产；可机械化，自动化、工业化生产，占地面积小；种苗质量好、无病菌，无病毒，遗传性能稳定，还不易受病虫害侵染；组培苗无性系的性状比传统无性系的性状更加一致；便于交流和打入国际市场；与其它生物技术相比，本项技术所需成本低，利润回报率高，但初期投资多，技术难度高。

 

组培苗具有无杂菌、优质、均匀、分蘖性强、繁殖率高、批量生产、周年供应、便于运输等优点。由于病毒的侵染，许多花卉的产量、质量不断下降，采用茎尖脱毒的技术，可以使病株复壮，经过脱毒的植株健壮、产量高、质量好、花色纯正，因此近年来花卉组织培养及快繁脱毒技术越来越多地应用于花卉种苗繁殖生产中。目前，利用植物的一小块组织，如生长尖、叶片、茎段、侧芽等作为培养材料，在特定的培养环境中，几个月就可以培养出成千上万株与原来植物完全相同的植物

 

7 前景

 

本技术应用范围广，不受地区限制，适用于各地花卉生产区、种苗场。生产单位可免除育苗工序，大大缩短栽培周期，减少温室土地、设备、劳力等资源的闲置和浪费，提高了花卉质量，使同样面积的土地和劳动力产生的效益成培增加，比使用常规方法繁育的花卉种苗生产的鲜切花，每亩效益增加35％～50％。花卉消费是物质文明和精神文明的象征，花卉业是一项新兴产业，是今后最有发展的十大行业之一，许多发达国家的大中城市数量最多的商店要数花店了。在我国随着人民生活水平和文化素养提高，花卉消费这一时尚已逐步进入家庭，这是一个巨大的消费市场。全国各地兴起许多花卉交易市场，对这种发展趋势又起着推波助澜的作用。

 

目前，生物技术正在世界突飞猛进地发展，在医学、农业、食品工业、能源工业、环境保护各个领域表现出极大的生产潜力。作为生物技术有力手段的组织培养也日益受到重视，在农林作物的脱毒快繁、突变诱发、细胞工程和基因工程等方面都可以发挥作用。

 

近40年来，植物组织培养技术得到了迅速发展，已渗透到植物生理学、病理学、药学、遗传学、育种以及生物化学等各个研究领域，成为生物学科中的重要研究技术和手段之一，并广泛应用于农业、林业、工业、医药业等多种行业，产生了巨大的经济效益和社会效益，已成为当代生物科学中最有生命力的一门学科。对农业、林业、蔬菜、果树、花卉以及药用植物新品种培育、品种脱毒、提纯复壮、快速无性繁殖、扩大种苗生产等方面均产生了划时代影响。