微生物限度检查验证试验

试验目的：进行微生物验证试验

背景知识（选填项目）：

原理（选填项目）：

实验仪器：高压蒸汽灭菌器、电子天平 、霉菌培养箱、电热恒温培养箱。

主体内容（操作步骤，必填项目）：

1、菌液制备：参考中国药典2005年版一部附录微生物限度检查法的菌液的制备方法，采用10倍稀释法制备菌液。

（1）． 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的肉汤培养物致至营养肉汤培养基中，置30～35℃培养18~24h，分别取上述培养物1ml加9ml0.9%的无菌氯化钠溶液，10倍稀释为10-4，细菌数约为50~100cfu/ml的菌悬液，做活菌计数备用。

（2）． 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，经25 ℃培养24~48小时，取上述白色念珠菌霉菌液体培养物1ml加9ml0.9%的无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10-5，细菌数约为50~100cfu/ml的菌悬液，做活菌计数备用。

（3）． 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，取经25 ℃培养5～7天，加3~5ml0.9%的无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸取出菌液， 用标准比浊管进行比浊后作为原液，然后取1ml加9ml0.9%的无菌氯化钠溶液，逐管10倍稀释为10-4，细菌数约为50~100cfu/ml的孢子悬液，做活菌计数备用。

（没有特殊要求的微生物限度检查，只需要培养枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌5个菌种。如需检沙门菌，则需要再培养乙型副伤寒沙门菌，如局部用栓剂等，菌种代数在5代以内。）

2、供试菌液的制备：参考中国药典2005年版一部附录微生物限度检查法的供试品液的制备方法，制备本品的供试品液。

平皿法：(常规法)

(1) 试验组：①取10个平皿，2个一组分成5组，分别做好大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的标记。

② 取1：10供试品溶液1ml，分别加入10个平皿中，再依次加入上述5种菌的菌悬液1ml(50～100cfu)，每株菌平行制备2个皿，立刻倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，分别置30～35℃培养48 小时和23～28℃培养72小时。

(2)菌液组：分别取上述稀释的菌液1ml注入平皿内，每个菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。

(3)供试品对照组：取1：10供试液1ml分别注入4个平皿中，立刻注入营养琼脂和玫瑰红钠琼脂培养基，每种培养基制备2个平皿，分别置30～35℃培养48 小时和23～28℃培养72小时，以测定供试品的本底菌数。

3、细菌、霉菌、酵母菌的方法学验证试验结果记录：

4、控制菌验证

（1）菌液制备：参考中国药典2005年版一部附录微生物限度检查法的菌液的制备方法，用10倍稀释法制备菌液。

（2）供试菌液的制备：参考中国药典2005年版一部附录微生物限度检查法的供试品液的制备方法，制备本品的供试品液。

（3）控制菌方法学考察结果表

 

结论：本品按中国药典2005年版一部微生物限度检查，经方法学验证试验，结果可用－－－ 法进行控制菌检验。