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包埋法固定化微生物问题初探(2)



录入时间:2011-8-2 14:58:27 来源:百度

 
(2)CaCl2浓度细胞活性的影响
在海藻酸钠包埋固定化过程中,凝胶化剂CaCl2中的Ca2+于海藻酸钠根离子螯合形成不溶于水的海藻酸钙凝胶,从而将细胞固定。CaCl2溶液的浓度对固定化细胞颗粒机械强度的影响见表四。
 
表四 CaCl2浓度对固定化细胞凝胶机械强度的影响
CaCl2浓度/%
2
3
4
5
10
机械强度
较好
较好
较好
 
随着CaCl2浓度的增加,微生物细胞的活性降低。当CaCl2浓度低于5%时,细胞活性可以保持在80%以上;但是当CaCl2浓度达到10%,细胞活性下降到60%左右,主要原因估计有两种(i)由于盐的渗析作用,引起细胞脱水,致使微生物活性部分丧失;(ii)在PCR技术中,CaCl2是使细胞处于感受态的物质,这个时候微生物是最脆弱的,很容易被外界的干扰破坏。
从表四可以看出,CaCl2浓度对固定化细胞的机械强度影响较大。当CaCl2浓度为2%~3%时,固定化颗粒在使用过程中会出现膨胀,甚至出现裂缝活破碎现象。因此,海藻酸钙包埋法固定化细胞活性较高。
3.2 PVA—H3BO3包埋法
3.2.1原理
聚乙烯醇是一种新型的微生物包埋固定化载体,它具有机械强度高,化学稳定性好,康微生物分解性能强,对微生物无毒,价格低廉等一系列优点,是一种具有实用潜力的包埋材料,近年来在国内外获得了较广泛的研究。
聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,简称PVA)的结构为:
 

    聚乙烯醇在加热后溶于水,在其水溶液中加入添加剂后发生凝胶化,或者在低温下(-10℃)冷冻形成凝胶,从而将微生物包埋固定在凝胶网络里。常用添加剂有硼酸和硼砂,在PVA水溶液中加入硼酸活着硼砂,由于化学反应而形成凝胶。PVA于硼酸反应形成的凝胶为单二醇型,与硼砂反应形成的凝胶为双二醇型,其结构式如图1(略)。
 
PVA于硼砂反应形成凝胶时,成形困难,凝胶呈海绵状结构,强度较低。但硼砂的用量较硼酸用量低得多,所以值的进一步研究。就目前的研究来看,大多采用H3BO3做交联剂。
PVA—H3BO3包埋法是一种制备容易且价格低廉的固定化方法,其反应原理如图2(略)。
利用该方法制得的凝胶颗粒机械强度高,使用寿命长且弹性好。
 3.2.2固定化方法
 以PVA为固定化载体,建立了利用PVA—H3BO3包埋固定化微生物细胞的方法,具体方法如下:
 方法I
①将聚乙烯醇(PVA)加热溶于水;
②将微生物细胞与PVA溶液混合均匀,使PVA最终浓度为10%;
③将上述混合液滴入饱和的硼酸溶液中,放置10h,使其充分反应;
④滤出固定化颗粒,用生理盐水洗净,备用。
方法II
①将聚乙烯醇(PVA)加热溶于水,冷却;
②将微生物细胞与PVA溶液混合均匀,使PVA最终浓度为10%;
③将PVA与微生物细胞的混合液到入已灭菌的培养皿中,缓慢加入饱和硼酸溶液,浸泡10h;
④将凝胶切成3mm×3mm×3mm的小方块,用生理盐水洗净,备用。
方法III
①将聚乙烯醇(PVA)与海藻酸钠加热溶于水,冷却;
②将微生物细胞与上述溶液混合均匀,使PVA与海藻酸钠最终浓度分别为7.5%~10%,0.4%~1.0%;
③将上述混合液用针形管滴入下列溶液中:
 H3BO3(饱和溶液) CaCl2 1.0%~5.0%  pH值4.0~7.0
④放置10h,使之充分反应;
⑤滤出颗粒,用生理盐水洗净,备用。
利用上述固定化方法,包埋固定化黑曲酶,比较了固定化细胞的活性,结果如表五所示。
 
表五 PVA—H3BO3法固定化的比较
固定化方法
方法I
方法I
方法III
固定化细胞相对活性/%
20.4%
23.1%
35.2%
 
从表五可以看出,采用方法III,即改进的PVA—H3BO3法固定化细胞,其活性明显提高,这是由于在方法III的固定化过程中,引入了少量的海藻酸钠。海藻酸钠作为一种多糖类天然高分子化合物,对微生物细胞器一定的保护作用,减轻了硼酸对微生物的毒性作用,因此提高了固定化细胞的相对活性。
3.2.3 PVA—H3BO3法中固定化试剂对细胞活性的影响
(1)    PVA对细胞活性的影响
   一般来说,PVA的浓度对微生物细胞活性的影响不大,即使高达10%时,对细胞活性也没有明显的不良影响。但是,PVA浓度增大,溶液的黏度随之增大,使底物和产物的扩散,尤其是氧气的传递受到影响,进而影响细胞活性。
(2)    H3BO3对细胞活性的影响
   硼酸的细胞毒性比较大,因而其对微生物细胞活性的影响是导致PVA—H3BO3包埋固定化细胞活性底的主要原因。
4、固定化细胞性能的评价
4.1固定化颗粒的密度
固定化颗粒是指一定体积内固定化颗粒的量, 因此,确定固定化颗粒的密度,也就是测定其体积和重量。但是由于固定化颗粒表面附着着一些水分,它不是固定化颗粒的组分,也无法通过过滤除去,可利用某些特殊溶剂(如葡萄糖)吸收,而这种溶剂不会扩散到固定化颗粒内,该溶剂被稀释的量即为附着的水量。这样,测定固定化颗粒的总量以及附着的水量即可通过计算的出其体积、密度和重量。具体方法此处不再详细叙述。
4.2固定化颗粒的通透性和机械强度
    固定化颗粒的通透性,也称为传质性能,是用来衡量的固定化细胞与外界交换能力的重要指标。通透性越好,固定化细胞与外界的物质交换越容易,固定化微生物对于外界污染物的降解能力越强。
    机械强度,主要衡量固定化颗粒在外界的持续压力冲击下保持形状的能力,一般来说,机械强度越大,颗粒可重复利用率越高,在工程上的应用价值越大。
    但是,通透性和机械强度是一对矛盾。在固定化过程中,固定化时间越长,颗粒的机械强度越大,但是通透性却降低;反之,固定化时间越短,通透性提高,机械强度却无法保证。因此,在实验中应该综合考虑两个因素,在两个指标中寻找最优的组合。
4.3固定化颗粒的最适温度、最适pH值
    固定化后的颗粒,由于在存在状态上与游离的微生物不同,因此在最适温度和最适pH值方面也会有很大的不同。可以通过做对照试验,测出不同组别在不同温度和pH值的条件下降解速率,从而找出最佳的降解的温度和pH值。
    同时可以看到,在固定化以后,微生物可以存在的温度和pH值范围比固定化以前有了显著的扩大。
4.4微生物的包埋量
    由于在制作固定化颗粒的过程中,不可避免的会有一部分微生物没有包埋到颗粒之中,这部分微生物不会参加对污染物的降解,因而在一定程度上会影响降解的效果。 因此包埋量的测定也是评价固定化好坏的一个很重要的指标。
    微生物的包埋量可以通过菌落技术的方法加以测定。
5、固定化微生物的发展趋势
    微生物在自然界中的物质转化和环境净化中起着非常重要的作用,微生物细胞是一个具有多种酶系统的统一体系,其本身就是一种天然的固定化酶反应器,因此利用固定化方法将微生物具体细胞加以固定,则可以用于催化一系列生理生化反应,固定化细胞内的酶体系十分稳定,且不影响其催化活性,具有造作和贮藏的良好稳定性。随着科学技术,尤其是生物工程以及工艺学的发展,开发应用固定化技术处理废水,已经引起国内外专家、学者的重视,并且逐步实现其在工业化生产实践中的应用。
    固定化细胞技术易其特有的优点在废水生物处理领域受到广泛关注,但是还有很多问题亟待解决,未来的主要研究方向主要集中于以下几点:
(1)    固定化载体类型以及包埋方式的研究;
(2)    寻找高效、廉价、抗毒性强的微生物;
(3)    开发多种生物共生的固定化载体;
(4)    开发具有良好流态的固定化反应器;
(5)    协同固定化的研究。
 
作者:韩斌 (南开大学环境科学与工程学院 环境科学系)
 
        
1、王建龙 生物固定化技术与水污染控制  北京 科学出版社 2002年
2、沈耀良等 固定化微生物污水处理技术 北京 化学工业出版社 2002.5
3、宋吟玲等 硝化细菌固定化细胞的研究   苏州城建环保学院学报 1999.12
4、严小军  细胞固定化的方法和应用  海洋科学  1993.3

 

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