厌氧性细菌分离培养法

细菌接种后，直接放在恒温箱内培养，可以使需氧菌与兼性厌氧菌生长繁殖；但对厌氧菌，则需将培养环境或培养基中的氧气除去，或将氧化型物质还原，降低其氧化还原电势，才能生长繁殖。在有氧的环境下，培养基的氧化还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。为使培养基降低电势，降低培养环境的氧分压是十分必要的。现有的厌氧培养法很多，主要有生物学法、化学法和物理学法，可根据各实验室的具体情况而选用。

（一）生物学方法

培养基中含有植物组织（马铃薯、燕麦、发芽谷物等）或动物组织（新鲜动物组织小片，或加热的肌肉、心脑等），因组织的呼吸作用，以及组织中可氧化物质的氧化而消耗氧气（肌肉、脑磷脂中不饱和脂肪酸的氧化，碎肉培养基的应用），造成厌氧环境，以利于厌氧性细菌的生长繁殖。同时，组织中所含的还原性化合物（谷胱甘肽）也可使氧化-还原电势下降。

此外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一环境中，则环境中的氧被需氧菌消耗，造成厌氧环境，也有利于厌氧菌的生长繁殖。

1. 动物组织及其他物质加入法  在液体培养基内加入肝脏、肾脏等动物脏器，因其中的半胱氨酸的一SH基极不稳定，为强还原剂，所以可利用此培养基进行厌氧培养，在培养之前将肝片肉汤加热，以驱出空气，冷却，然后接种培养。

2. 共栖培养法  将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一个平皿内，利用需氧菌的生长繁殖将氧气消耗后，造成厌氧环境利于厌氧菌生长。其具体方法是将培养皿的一半接种消耗氧气能力极强的需氧菌如灵杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌等。另一半接种厌氧菌， 接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37℃恒温箱中培养2～3d， 即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。

（二）化学方法

利用还原能力强的化学物质，将环境或培养基内的氧气消耗，或还原氧化型物质，降低氧化-还原电势。

1. 焦性没食子酸法  焦性没食子酸在碱性溶液内能大量地吸收氧而造成厌氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖。通常100cm³空间用焦性没食子酸1g及10％氢氧化钠或氢氧化钾10m1。具体方法有下列几种：

（1）平板培养法  将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板，取一小团直径约2cm的脱脂棉，置于平皿盖的内面中央，其上滴加0.5ml 10％氢氧化钠溶液；在靠近脱脂棉的一侧放置0.5g焦性没食子酸，暂勿使两者接触。立即将已接种的平板覆盖于平皿盖上，迅速用融化的石蜡密封平皿四周。封毕，轻轻摇动平皿，使被氢氧化钠溶液浸湿的脱脂棉与焦性没食子酸接触，然后置37℃恒温箱中培养24～48h后，取出观察。

（2）Buchner氏试管法（图4-4）  取一大试管，在管底放焦性没食子酸0.5g及玻璃珠数个或放一螺旋状铅丝。将已接种的培养管放入大试管中，迅速加入2％NaOH溶液0.5ml，立即将试管口用橡皮塞塞紧，必要时周围用石蜡密封。37℃培养24～48h后观察。

（3）瑞氏厌氧培养法（图4-5）  将已接种细菌的培养管的脱脂棉棉塞在火焰中灼烧灭菌后，塞入管中离培养基1～1.5cm处，置适量焦性没食子酸于其上，加入10%NaOH溶液2ml，迅速用橡皮塞将管口塞紧，以胶泥或石蜡严密封闭置温箱中培养。

（4）史氏厌氧培养法  用图4-6所示的厌氧培养皿，在皿底一边置焦性没食子酸，另一边置NaOH溶液，将已接种的平皿翻盖于皿上，并将接合处用胶泥或石蜡密封，然后摇动底部，使氢氧化钠与焦性没食子酸混合，置温箱中培养。

（5）平皿厌氧培养法  置一片中有小圆孔的金属板于两平皿之间，上面的平皿接种细菌，下面的平皿盛焦性没食子酸及氢氧化钠溶液，用胶泥封闭后置温箱中培养（图4-7）

（6）玻罐或干燥器法  置适量焦性没食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，将培养皿或试管置于隔板上，并在玻罐内置美兰指示剂一管，从罐侧加入氢氧化钠溶液于罐底，将焦性没食子酸用纸或纱布包好，用线系住，暂勿与氢氧化钠接触，等一切准备好后，将线放下，使焦性没食子酸落入氢氧化钠溶液中，立即将盖盖好，密封，置温箱中培养。

    2. 李伏夫（B.M.JIbBOB）氏法  此法是利用连二亚硫酸钠（Sodium hyerosulphite）和碳 酸钠以吸收空气中的氧气,释放二氧化碳造成厌氧环境。其反应式如下：

Na₂S₂O₄+Na₂CO₃+O₂→Na₂SO₄+Na₂SO₃+CO₂

取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内（如是液体培养基，则直立于罐内），最上端保留可容纳1～2个平皿的空间（视玻罐的体积而定），按玻罐的体积每1000cm³空间用连二亚硫酸钠及碳酸钠各30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。若用无盖玻罐，可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐置于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭,如图4-8所示。

3. 硫乙醇酸钠法  硫乙醇酸钠是一种还原剂，加入培养基中，能除去其中的氧或还原氧化型物质，促使厌氧菌生长。其它可用的还原剂包括葡萄糖、维生素C及半胱氨酸等。

（1）液体培养基法  将细菌接入含0.1%的硫乙醇酸钠液体培养基中，并加入美兰溶液作为氧化还原的指示剂，37℃培养24～48h后观察，在无氧条件下，美兰被还原成无色。

（2）固体培养基法  利用特殊构造的Brewer氏培养皿，可使厌氧菌在培养基表面生长而形成孤立的菌落。具体方法如下：先将Brewer氏培养皿干热灭菌，将溶化冷却至50℃左右的硫乙醇酸钠固体培养基倾入皿内。待琼脂冷凝后，将厌氧菌接种于培养基的中央部分。盖上皿盖，使皿盖内缘与培养基外围部分相互紧密接触（图4-9）。此时皿盖与培养基中央部分留在空隙间的氧气被硫乙醇酸钠还原，美兰指示剂逐渐褪色，而外缘部分，因与大气相通，仍呈蓝色。将Brewer氏培养皿于37℃恒温箱内24～48h后观察。

（三） 物理学方法

利用加热、密封、抽气等物理方法，以驱除或隔绝环境及培养基中的氧气，造成厌氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖。

1. 厌氧罐法  常用的厌氧罐有Brewer氏罐、Brown氏罐和Mc1gtosh－Fildes二氏罐（图4-10）。将接种好的厌氧菌培养皿依次放于厌氧罐中，先抽去部分空气，代以氢气至大气压。通电，使罐中残存的氧与氢经受铂或钯的催化而化合成水，使罐内氧气全部消失。将整个厌氧罐放入温箱培养。

2. 真空干燥器法  将接种好的平皿或试管放入真空干燥器中，开动抽气机，抽至高度真空后，替代以氢、氮或二氧化碳气体。将整个干燥器放进孵育箱中培养。

3. 加热密封法  将液体培养基放在阿诺氏锅内加热10min，驱除溶解液体中的空气，取出，迅速置于冷水中冷却。接种厌氧菌后，在培养基液面覆盖一层0.5cm的无菌凡士林石蜡。置37℃培养24～48h后观察。

4. 高层琼脂柱法  加热融化一管适合分离厌氧菌用的琼脂培养基，待冷至50℃左右，接入少许经适当稀释的待分离的培养物或含菌材料，充分摇震均匀。在琼脂凝固前，迅速以无菌滴管吸取上述已接种的琼脂培养基，注入准备好的玻璃管内（长约15 cm，一端塞小胶塞或小木塞，另一端塞棉花塞，高压灭菌备用），装至4／5左右之处，塞好棉花塞，放在大试管或玻璃筒内，置37℃恒温箱中培养。长出菌落后，拔去胶塞和棉花塞，以无菌玻棒将琼脂柱推出于无菌平皿中，再用灭菌接种环钓取独立菌落作厌氧纯培养。

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