病毒学实验技术（5）

细胞的制备

应用细胞种类很多，兹以原代猪肾细胞为例。

（一）无菌取胚胎或仔猪肾。

（二）去肾被膜，切开肾为两半，剪去肾盂及髓质部。

（三）以含青霉素各200单位／ml的磷酸盐缓冲盐水洗去血球，用剪刀剪成约小米粒大的小块，移于灭菌三角瓶中。

（四）再用含抗菌素的磷酸盐缓冲液洗3～4次至洗液彻底清亮为止。

（五）加入3～4倍以上体积的35℃胰酶液，在电磁搅拌器上搅拌消化（如无电磁搅拌器可置40℃水浴锅中，内加无菌玻璃珠摇动），搅拌（或摇振）时以发生旋涡而不起泡沫为度，至液体明显混浊时（约10分钟左右），再用吸管或注射器吹打数次，待组织块沉淀后，将上层被消化后的细胞吸出，再加入消化液，将余下组织块再同样消化于40℃10～20分钟，再次吹打，分散细胞，将两次消化液汇合一起，经四层纱布过滤，收集滤液，离心（1500转／分，10分钟），弃上清液，加入含抗菌素的（见前述）汉克斯氏液悬浮，再离心，弃上清，加入营养液（见下述）悬浮，再离心。

亦可将组织块在4℃下消化16～24小时（所谓冷消化法），搅拌，吹打，收集细胞液，离心，同上述。

（六）末次离心后，弃上液，加入少许营养液悬浮，用计算白血球的方法计算每毫升中细胞数，计数发现细胞太多时可取少许浓细胞液加营养液适当稀释后再计。

 （七）根据计数结果，以营养液稀释到每毫升含肾细胞100万个。有经验的工作人员，可以不计数，稀释细胞到适当的混浊度即可。

营养液：取10 ml小牛血清，80ml汉克斯氏液和10 ml  5％乳蛋白水解物配成营养液，加双抗使每ml营养液中含青、链霉素各200单位。青、链霉素事先可配成各20000单位/ml的溶液。

（八）分装于小玻瓶（小型实验室可用空的链霉素瓶，洗净，灭菌）中，链霉素瓶装1ml，并以蜡笔作瓶的上下记号。

平放静置37℃孵育两天后，每日检查，至长成单层为度，快则2～3天，慢则6～7天。如液体混浊说明有细菌生长，并往往变酸或有霉菌生长时，应废弃。

（九）换液加病毒

长成单层后，吸弃营养液，加入9ml维持液。维持液中血清含量比营养液少一半（抗菌素含量同上）。接种含病毒的材料0.1ml，放回温箱再培养。

（十）观察及收获病毒  每日检查一次，凡有霉菌及细菌生长者弃之。病毒在其中生长，可引起细胞变性，原生质出现颗粒状，核浓缩或裂解，有的还明显的引起细胞溶解，出现空斑。发现有细胞变化或空斑时，即可将液体收集保存，同时做无菌检验。所收集的液体即繁殖的病毒液。有的病毒在细胞培养上生长，但细胞不出现病变，此时应以其它方法检查，如回归动物、END法、荧光抗体检查等等。

瓶上细胞检查可作为一个标本保存，即吸去内溶液以后，经甲醇固定，姬姆萨液染色，水洗，干燥后保存。

传代细胞比初代细胞易于操作，在玻璃器皿内更易于适应，其性能（如所用的或可用的培养液、细胞的形态、细胞生长速度、细胞的保存等）是知道的，故较原代细胞常用。兽医实验诊断室最好备有传代细胞，以便于从事病毒病的微生物学诊断。

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