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阿维菌素试验方案

录入时间:2011-8-12 15:13:54 来源：生物在线

培养基
（1）斜面和分离培养基(g／L)：可溶性淀粉10，(NH4)2SO4 2．5，NaC1 0．6，MgSO ·7H2O 1．2，K2HPO4·3H2O 3．0，CaCO3 3．0，琼脂粉 20，pH 7．2～7．4，用蒸馏水配制。
种子培养基(g／L)：玉米淀粉25，花生饼粉1O，黄豆饼粉8．0，酵母粉5．0，酵母膏5．0，玉米浆4．0，CoCl2·6H2O 0．003，淀粉酶0．0025，pH7．O～7．2．用自来水配制。
发酵培养基(g／L)：玉米淀粉7O，花生饼粉1O，黄豆饼粉8．0，酵母粉5．0，酵母膏3．0，玉米浆2．2，CoCl2·6H2O 0．003，淀粉酶0．0025，pH7．O～7．2．用自来水配制。
（2）见笔记本
培养方法
从平板上挑取灰色丰满的单菌落，转接于斜面，28℃培养7～9 d．待长出丰富的灰色孢子后，转接于种子培养液，220 r／min，28℃摇床培养28～30 h，接种5％于发酵培养液(250 ml三角瓶，装50ml发酵液)，220 r／min，28℃摇床培养7～9 d，放瓶测定各指标。
3．诱导子制备
（1）藻多糖提取工艺
    取海藻置于托盘放入恒温培养箱低温烘干，用电磨机打碎，使之成粉末状。用天平称取海藻粉50g放入500ml锥形瓶中加蒸馏水250ml放置于95℃水浴锅中，并隔10min晃一次，4h后取出，冷却到室温。离心取上清液，在离心管中加无水乙醇，得到沉淀再次离心，取沉淀(多糖)，用蒸馏水冲洗数遍，于37度烘箱中烘干所得沉淀为粗多糖。
（2）1 多糖提取工艺紫菜一粉碎一紫菜干粉(40目)(加水(40-50倍)一微波加热浸提-粗滤-离心(4000r/min,10min )-浓缩-45℃真空千燥一紫莱多糖（微波功率200w，加热时间8min，水与紫菜液固重量比为50:1）
2 多糖含量的分析方法还原糖的测定:采用3.5一二硝基水杨酸比色法[51.总糖含量的测定:采用苯酚一硫酸比色法，以葡萄糖为标准品
3 紫菜多糖的计算多糖含量(%)=0.9x(总糖百分含量一还原糖百分含量)X100%，其中0.9是多糖的换算系数;紫菜多糖提取率(%)=紫菜多糖的含量/紫菜原料的质量x 100%.
（3）将用来制备诱导子的6种微生物分别接种到相应的液体培养基中进行摇床振荡培养．其中，粗糙脉孢菌、紫红曲霉在马铃薯葡萄糖液体培养基中25℃培养7 d；掷孢酵母、深红酵母在麦芽汁液体培养基中25℃培养3 d；N89在营养肉汤培养基中28℃ 培养5 d；A05在蛋白胨查氏液体培养基中28℃ 培养10 d、分别收集培养好的菌体细胞，按Ayers 方法来制备诱导子．取2 g(湿重)的菌体细胞，用蒸馏水、100 mmol／L和500 mmol／L(pH 7．2)的PBS缓冲液分别洗涤2次，超声破碎细胞，离心收集沉淀，沉淀再用500 mmol／L(pH 7．2)的PBS缓冲液和蒸馏水分别离心(4 000 r／min，5 min)洗涤8次，并重悬于蒸馏水中，0 1 MPa灭菌20 min后，置一20℃ 下储存备。
4. 效价测定
（1）层析法分离纯化，HPLC 法测定效价(任超，马珦玻.阿维菌素B1a组分高产菌株诱变育种。生物技术通报，2005，4)
取发酵液5 ml，3 000 r／min，离心10 min，弃上清。加入丙酮2 ml，在旋涡式混合器上振荡1 min，静置10 min，重复3次。加入乙酸乙酯3 ml，振荡1 min，3 000 r／min，离心10 min，上清液备用。
吸取4Oμl上清液点样于GF254硅胶板上，然后层析。展层剂为：乙酸乙酯：三氯甲烷：二氯甲烷：无水:甲醇=9：9：2：1。层析后在紫外灯下观察，将斑点处硅胶刮入离心管中，加入2 ml无水甲醇，在旋涡式混合器上振荡1 min，静置10 min后3 000 r／min，离心10 min。
HPLC分析采用C18反向柱，流动相为无水甲醇：水=85：15，流速1 ml／min，检测波长244．6 nm。准确吸取5．0μl样品滤液进样，根据各组分的峰面积，对照标准曲线计算其含量，各组分之和即为总发酵单位。
（2）紫外分光光度法(对于斜面培养物)( 于秀莲，何建勇，白秀峰. 阿维菌素产生菌的诱变育种. 沈阳药科大学学报, 第21卷第3期)
将适量的斜面培养物铲出置于离心管中，加入丙酮2 mL，浸泡后再加入乙酸乙酯2 mI ，在旋涡式混合器上震荡2 min，3 000 r／min离心10 min，所得萃取液在754紫外分光光度计波长244 nm下，以甲醇为对照，测定样品的光密度，根据预先制备的光密度一阿维菌素标准曲线，计算阿维菌素的效价。
（3）HPLC 法（同上）
色谱柱为kromasil Cl8(200 mm×4．6 ram)，流动相为甲醇-水(80：20)，流速1 mL/min。
取发酵液7 mL于离心管中。3 000 r/min离心10 min，弃去上清液。加入丙酮2 mL。在旋涡式混合器上震荡2 min，静置10 min，再加入乙酸乙酯5 mL，震荡2 min，再以3 000 r/min离心10 min，得萃取液，用0．45 m的微孔滤膜过滤，准确吸取5．0 μl样品滤液进样，根据峰面积值进行计算
5．菌丝量（细胞干重），pH值
6．糖耗
总糖的测量：采用苯酚-硫酸比色法，以葡萄糖为标准品。
残糖含量：采用3、5一二硝基水杨酸比色法。
7．电镜、细胞膜通透性
8．活性氧(ROS)
9．质谱对比分析代谢物组变化

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