包涵体的分离

一旦一个稳定的、重复的发酵过程建立起来，则要考虑提取包涵体的步骤了。包涵体处在细胞质内或者细胞的外周质，必须破坏细胞膜才能把包涵体释放出来。 　　溶液中的包涵体也要同破碎液中溶解的成分和不溶的其它成分如细胞碎片、细胞膜以及核糖体等成分分离开来。 提取的第一步是冷却发酵液，利用离心或者错流过滤的方法收集细胞，细胞的沉淀利用设定的含有一定浓度的离子强度（0.4-0.6mo1）的缓冲液悬浮。这种缓冲液必须控制pH、离子强度、重金属的浓度和氧化还原的环境，在以后的操作步骤中也要考虑这些因素。 　　由于包涵体比细胞可以耐受更大的剪切力，所以可以使用的破碎细胞的方法有很多。对于大肠杆菌，最经常使用的方法是高压匀浆的方法，可以使细胞完全破碎，并且这种方法可以以不同的规模使用，2到5个循环可以使细胞完全破碎。酵母细胞由于含有更加有弹力的细胞壁，所以需要的循环可能更多，或者在容器中加入一些玻璃颗粒。破碎细胞还可以使用物理的方法如超声，或者化学的方法如化学试剂和酶，如溶菌酶和EDTA（乙二胺四乙酸）来破碎细胞。 　　包涵体可以使用过滤或者离心的方法，把细胞破碎液中的其它成分除去，这两种方法利用了包涵体的不同物理特性。由于包涵体和可溶蛋白质的体积不同，所以可以使用过滤的方法，这种方法可以降低操作成本，易于放大。一些实验已经证明过滤的方法是分离包涵体的有效的手段，但是这种方法也存在着一些缺点：过滤膜很容易被一些不透过的成分所堵塞，即使使用错流过滤或者使用很高的流速，这种情况都不能避免。并且，由于微孔膜是根据成分的大小来分离的，一些细胞碎片也容易与包涵体混在一起。 　　而包涵体蛋白质的密度比相同体积的细胞碎片的密度大得多，所以使用离心的手段可以把包涵体与细胞的其它成分分离开来。如果细胞碎片没有同包涵体分离，在以后的分离手段中必须把膜上的组分分离开来。有时，有些目标蛋白质以溶解的形式存在，可以通过在细胞破碎以前加入一些非极性的物质（如苯酚、甲苯）或者去垢剂，通过这个方法可以提高从大肠杆菌表达的人生长激素包涵体的收率。

　　连续离心技术是工业生产中获得包涵体最经常使用的操作。由于细胞碎片的密度比包涵体小，则沉降的速度比包涵体要小，连续的悬浮、离心可以把大部分的包涵体离心下来，而细胞碎片逐步除去。SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酞胺凝胶电泳）分析发现，离心的方法可以达到沉降物中的蛋白质的含量大于90%。

     当细胞碎片与包涵体混在一起难于分离时，可以采用一些化学的方法把细胞碎片离子交换色谱复性蛋白质与包涵体分离开，否则溶解包涵体以后，膜蛋白质溶在包涵体蛋白质的溶液中，会污染以后的操作。特别如果一些膜蛋白质具有蛋白质酶的活性，则溶解以后的包涵体蛋白质可被降解。如果溶解原核细胞膜蛋白质的一些溶剂不能溶解包涵体蛋白质时，可以使用溶解的方法把膜蛋白质除去。最经常的选择性溶解膜蛋白质的方法是利用鳌合金属的试剂如EDTA、中性的去垢剂如Triton X-100，或者一些盐如，脱氧胆酸盐，或者弱离液剂，如2mol/L的脲。Babbit等人发现经过前面的步骤，可以提高肌氨酸激酶的复性收率，活性提高的原因是使用弱的去垢剂辛基糖除去了蛋白质酶。

　　离心和高压匀浆都有可能产生泡沫，所以必须在工业规模中避免这种无谓的损失。有些工业生产中，分离以前在发酵罐中把细胞杀死使细胞内的物质释放出来，并同时溶解或者不溶解包涵体蛋白质。这种在线杀死细胞的方法己经用来生产两种蛋白质：在碱性条件下溶解类胰岛素生长因子和高温、酸性条件下生产重组的抗真菌肽段。这种方法的优点是可以节省操作时间以及能量消耗，仅仅需要一步离心的步骤。最经常使用的杀死细胞的试剂有苯乙醇，辛酸，氯仿，甲苯等。杀死细胞时也有缺点，溶解的目标蛋白质中含有蛋白质或者非蛋白质的物质，降低了蛋白质的纯度；如果目标蛋白质没有被溶解，则杀死细胞会使可溶蛋白质产生沉淀，使得包涵体的纯化比较困难，或者破坏包涵体内部的重组蛋白质。

 

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