植物病毒病检测方法（三）

1.4.3 电子显微镜计数

本世纪三十年代初电子显微镜的发明，使我们能够观察到病毒的分子及其细微结构。1940年Kausche和Melcher首次在电子显微镜下观察到烟草花叶病毒的颗粒。电镜技术的建立对病毒学的发展起了巨大的推动作用。

在实际生产过程中，根据病毒的种类与特点的不同，往往需要把几种方法结合起来，就可望建立一套快速、灵敏、准确、高效的水体植物病毒的检测方法。

1.4.4.分子生物学法

分子生物学检测法能够检测病毒的侵染能力。此方法灵敏度最高，能检测到pg级甚至fg级[1ｆｇ(飞克)=1×10-15ｇ]的病毒,特异性强，检测速度快，操作简便，可用于大量样品的检测(侯义龙,2000)。目前,常用的分子生物学方法有核酸分子杂交技术、dsRNA电泳技术、多聚酶链式反应技术等。侯义龙.果树主要病毒RT-PCR检测体系的建立、优化及病毒特异DNA片段克隆测序研究.[博士学位论文].沈阳:沈阳农业大学,2000.6

核酸分子杂交技术 具有一定同源性的2条核酸单链在一定的条件下(适宜的温度及离子强度等)可按碱基互补原则退火形成双链。此杂交过程是高度特异性的。杂交的双方是使用的探针和要检测—的核酸。待测核酸可以是克隆的基因片段,也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。根据使用的方法,被检测核酸可以是提纯的(膜上印迹杂交或液相杂交),也可以在细胞内杂交(细胞原位杂交) (卢圣栋，1999)。

双链RNA(dsDNA)电泳技术 ssRNA病毒在植物体内增殖,通过核酸互补而形成一种健康植物没有的碱基配对dsRNA。DsRNA经提纯、电泳、染色后,在凝胶上所显示的谱带可以反映每种病毒组群的特异性,并且有些单个病毒的dsRNA在电泳图谱上也显示一定的特征。因此,利用病毒dsRNA的电泳图谱可以检测出病毒的类型和种类（董颖苹,2001；李鹏翔，2000）。此法已用于一些病毒组(如黄化病毒组、马铃薯Y病毒组、番石竹潜病毒组、烟草坏死病毒组、黄瓜花叶病毒组、绒毛烟斑驳病毒组)的分类研究。

多聚酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)技术 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，是近10年来发展和普及最迅速的分子生物学新技术之一(吴乃虎，2000；)。由于它具有强大的扩增能力,并且可与其它分子生物学方法(如核酸杂交)和免疫学方法(如ELISA)相结合应用,使其敏感性和特异性都大大增强；因而广泛地应用于生物医学领域的各个学科（梁国栋，2001）。灵敏度最高, 仪器价格昂贵，试验技术要求高。

上一篇：植物病毒病检测方法（二）

下一篇：腺病毒体外在293细胞中大量扩增的方法