包涵体的纯化（三）

三、关于包涵体的溶解：

1、 请教GST包涵体溶解

直接用8M的脲或 6M胍融解，取上清，测浓度。直接稀释后包被检测相应抗体。（由于快速稀释相当于复性过程，产物用于检测没有问题的）

我所用的包涵体提取方法：

1．PBS或生理盐水洗涤诱导后菌体，Buffer A重悬菌体，超声波破碎至清亮

２．４度，１００００rpm离心１０分钟，弃上清

３．用ＰＢＳ或生理盐水洗涤沉淀２－３次

４．往沉淀中加１９．７ml Buffer A及０．３ml　２０％的ＳＫＬ（十二烷基肌氨酸钠）贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室温静置３０分钟至２小时

５．４度，１００００rpm离心１０分钟，取上清

６．加２０％ＰＥＧ４０００　２１０ul至终浓度为０．２％，加５０mM的氧化型谷胱甘肽４２０ul至终浓度为１mM,加100mM的还原型谷胱甘肽４２０ul至终浓度为２mM,静置３０分钟至２小时（亦可４度复性过夜）

７以ＰＢＳ（pH8.0)或ＴＥ（pH8.0)透析，取出－２０度保存备用

！Buffer A配方：

　　　Tris-base 50mM

EDTA 0.5mM

NaCl 50mM

甘油　　5%

DTT 5mM

2、包涵体的溶解

十二烷基肌氨酸钠与十二烷基肌氨酸在溶解包涵体时，可不可以互相代替？可以替换，调pH不久没什么区别了吗；两者的功能团相同，pH不同，前者钠盐便于保存罢了

3、有关包涵体的溶解问题

强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等是去垢剂，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。

4、8M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存?

我在4度放了半个月，目前没出什么问题

5、8M尿素溶解的包涵体溶液在室温下可以放多久而不出现问题?

BI溶液在室温放置48小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，因而早些处理BI溶液比较好。具体有什么影响我也不是很清楚。

6、GST融合蛋白形成包含体不溶，咋办？

GST融合蛋白应该不能用尿素等作用太强的变性剂，否则GST融合蛋白是不能与beads相结合的

GST的Beads是应用酶与底物结合的原理，所以要去除处理因素后才好结合，不知你的温和的去污剂是什么？

做完裂解之后加Triton　X－100轻摇３０min，蛋白溶解的会多些！

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