硝化细菌的分离、培养和观察

硝化细菌是生物界中一类特殊的生产者，能进行硝化作用参与氮素的转化

 

仪器与试剂：

恒温箱、高压灭菌锅、天平、量杯、玻棒、大试管、三角瓶（250毫升）、显微镜、白瓷板、α—萘胺试剂、二苯胺试剂、醋酸、磺胺酸，革兰氏试剂、PH试纸、(NH4)2SO4、NaH2PO4、K2HPO4、Na2CO3、MnSO4•4H2O、MgSO4•7H2O、NaNO2、NaOH(0.1N)、HCl(0.1N)、浓H2SO4、蒸馏水。

 

实验过程：

（一）   配制硝化细菌培养液：

NaNO2	1g
MgSO4·7H2O	0.03g
MnSO4·4H2O	0.01g
K2HPO4	0.75g
Na2CO3	1g
NaH2PO4	0.25g
蒸馏水	1000ml

培养液pH值用0.1NNaOH或0.1NH4Cl调至7.0～7.2。

 

（二）灭菌

将配制好的培养液分装在大试管中，每管约15毫升，堵上包有纱布的棉塞，放在高压灭菌锅中，15磅30分钟灭菌备用。

 

（三）样品采集：

采用公园下层湖水约100毫升即可。

 

（四）接种：

用吸管吸取样品，每支试管接1～2毫升样品。

 

（五）培养：

置于28～30℃恒温箱中静置7～10天。

 

（六）结果测定：

 

1、配制试剂：

（1）α—萘胺试剂的配制：用天平称取α—萘胺5克于100毫升醋酸(5N)中，用玻棒搅拌溶解。

（2）二苯胺试剂的配制：用天平称取0.5克二苯胺溶于100毫升浓浓H2SO4中，再加入20毫升蒸馏水中搅拌稀释。

 

2、NO2-的检验：

在瓷盘小孔内各加入1滴α-萘胺试剂，然后加少许试验液，变红色的为(+)，未变色(黄色)的为(-)。

 

3、NO3-的检验：

（1）先除去培养物中的NO2-：方法是在培养物中加入醋酸5～8滴，使之酸化，再加入数粒磺胺酸，当停止放出气体时，再加入一粒磺胺酸，此过程中NO2-转化为N2而逸出。用α-萘胺试剂检查，如不出现红色，证明培养物中不含NO2-。

（2）检验NO3-的产生：方法是吸取培养物少许于白瓷板凹窝中，滴入二苯胺试剂，如有蓝色出现，即证明有NO3-的积累。

 

（七）富集培养：

将测定为(+)的菌液接入装有100毫升培养液的250毫升三角瓶中(培养液已灭过菌)，置28～30℃恒温箱中培养，待生长后测定结果为(+)再接另瓶培养液中进行培养。如此经多次移接，可使培养液的亚硝化细菌和硝化细菌逐步增多。

 

（八）观察：

将菌液制成涂片，经革兰氏染色后，显微镜下观察菌体形态。