食源性致病菌检测技术（1）

单核细胞增生李斯特氏菌

    单核细胞增生李斯特氏菌（简称LM）是一种人畜共患病的病原菌。感染后主要 表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。 

1．常规分离鉴定技术

    常规检查：直接涂片检查可见革兰氏阳性短杆菌。

    细菌学检查：食品、水等相关食源性标本检测按照[GB/4789-2003]方法进行，其它标本直接分离于TSA-YE或其它李斯特氏菌选择性琼脂平板，在有氧环境下培养，30℃培养24-48h后，选择典型菌落进行生化鉴定及动力试验。 

    小鼠毒力试验：将分离的菌株接种到10mlTSB-YE肉汤中，35℃培养24h，将培养物离心、浓缩，用1ml生理盐水制成菌悬液（浓度为1010个菌/ml），取0.1ml腹腔注射体重为16-18g小鼠,每组5个观察7d内小鼠死亡情况。用已知致病的LM和非致病的英诺克李斯特氏菌相同方法进行，做对照试验。 

    协同溶血试验：在羊血琼脂平板上平板接种β-溶血金黄色葡萄球菌和马红球菌，在它们中间垂直划线接种可疑菌，与两线相近但不相关，在30℃培养24h-48h，检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的LM的溶血增强，西尔李斯特氏菌的溶血也增强，绵羊李斯特氏菌在马红血球附近的溶血增强。 

    毒力基因鉴定：包括Hly、PlcA、PlcB、ActA、PrfA、Inl、Iap和Mpl等。以上基因检测，均可使用PCR方法进行。所用引物，可采用国际、国内、或著名刊物公开发表的引物。模板DNA的提取可采用热裂解法，经过PCR扩增和凝胶电泳对扩增产物的鉴定，判断被测菌是否携带相关的毒力基因。PCR检测：用PCR技术对LM的特异性进行研究，经引物LA1和LB2、LMIR和LM3F扩增产生区别于其它革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌的590bp，340bp的片段，为Lm的特异性检测提供了依据。 

2．分子流行病学分型方法

    血清型分型：根据菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原，将LM分成16个血清型，分别是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e、5、6a、6b和7。致病菌株的血清型一般为1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b和5。 

    方法为将待鉴定菌接种到TSA-YE琼脂斜面菌苔洗下，菌悬液于80℃水浴中加热1h，以2500r/min离心30，弃去上清液，将剩余液与沉淀混匀制成菌悬液，进行血清学玻片凝集试验。 

    脉冲场电泳（PFGE）分型：LM的血清型能用PFGE图谱反映。Ojeniyi等认为，同一个PFGE亚型的LM的血清型是相同的，但相同血清型的LM菌株PFGE亚型则并不一定相同。PFGE分型较血清分型、酶电泳分型、RT、RAPD分型方法的分型能力均强。但建立PFGE电泳系统的花费昂贵，不利于其在流行病学调查中的大规模应用。 

    随机引物扩增DNA多态性分析（RAPD）分型技术：RAPD分型法对于某一地区及不同地区间李斯菌暴发或散发流行病学的研究、发现新的流行株及其来源都有重要意义。但是由于采用的引物短，T值低，扩增结果易受到外界因素的影响，实验的重复性较差。

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