食源性致病菌检测技术（4）

 霍乱弧菌

    霍乱弧菌（V.cholerae）污染食品，可引起食源性疾病的暴发。主要表现为剧 烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高。属于国际检疫传染病。  

1．常规和快速检验技术

    剧烈腹泻病人的水样便可直接分离在庆大霉素、4号琼脂、或TCBS、弧菌琼脂等平板上，36℃培养10-20小时，挑取可疑菌落与霍乱多价血清作玻片凝集试验和生化鉴定。恢复期病人，带菌者或用过抗菌药的病人粪便、肛拭、食品与其它环境标本（如水、苍蝇、昆虫等）必须增菌后分离，获得纯培养物进行各项试验进行菌种的鉴定。方法见中华人民共和国卫生部《霍乱防治手册》1987年。 

2．快速辅助诊断

    制动试验：取急性病人水样粪便一滴于玻片上，直接用显微镜观察，可见到具有流星状动力的细菌，然后加上一滴霍乱免疫血清后，运动停止，凝结成块，即可初步诊断为霍乱弧菌。  

    早期玻片凝集法：挑取庆大霉素琼脂平板较大菌落直接与霍乱多价诊断血清作玻片凝集试验，凝集者既可初步报告阳性。  

    免疫荧光菌球菌法：将增菌培养物接种于含有霍乱荧光抗体的蛋白胨水中，37℃培养4-6小时，在荧光显微镜下可观察到呈现荧光菌球者，即为菌球阳性。也可将标本与荧光抗体混合后离心取沉淀物涂片在显微镜下观察，同样呈现荧光菌球者，即为菌球阳性。此方法适合于外环境标本的检验。  

    SPA协同凝集试验：将菌培养液与SPA诊断试剂作玻片凝集试验，出现（++）凝集时，将该培养液煮沸再作一次凝集，如仍出现（++）凝集时，可作初步阳性报告，同时可将未经加热的凝集块进行分离培养。  

3．流行病学分型技术

生物型的鉴别

    第Ⅳ组噬菌体（106/毫升）裂解试验：第Ⅳ组霍乱噬菌体常规稀释液（106/毫升）一般只裂解霍乱弧菌古典型，而不裂解埃尔托型（有少数例外）。第Ⅳ组霍乱噬菌体原液（109/毫升）对古典型、埃尔托型均能裂解。 

    多粘菌素B敏感试验：在冷却至约50℃的普通琼脂中加入多粘菌素B（50单位/毫升），混合后制成平板。然后将2-3小时的菌培养物一环接种在平板。然后将2-3小时的菌培养物一环接种在平板表面，待干后置37℃培养过夜，观察结果。古典型敏感（不生长或生长不足10个菌落），埃尔托不敏感（多粘菌株形成菌苔）。也可用多粘菌素B纸片（50单位）按药敏感试验方法进行。  

    鸡血球凝集试验：加一滴生理盐水于玻片上，挑取被检菌培养物于盐水中制成浓厚的菌悬液，取一滴2.5%鸡血球悬液混于菌悬液中,摇匀,一分钟内出现血球凝集者为阳性,血球呈均匀分散状态为阴性。埃尔托型为阳性，古典型一般为阴性。  

    ＶＰ试验：将被检菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，于３７℃培养２－３天后，取出１毫升加５％α－奈酚酒精溶液０．６毫升，震荡５秒钟，再加入４０％氢氧化钾０．２毫升，再震荡５秒钟，于室温中放置２－５分钟，１小时内出现红色者为阳性。古典型为阴性，埃尔托型多为阳性。

噬菌体、生物分型：为区别埃尔托型的两类不同菌株（流行株与非流行株）和不同菌型，对不同来源的菌株进行分型，可追溯病原的来源。  

    噬菌体分型：根据５株噬菌体（ＶＰ１－ＶＰ５）可将埃尔托弧菌分成３２个噬菌体型，常见的流行株为噬菌体１型（对５株噬菌体型全敏感）、３～５型，２型主要是１型的粗糙型，６型以后属非流行株。

埃尔托弧菌生物分型：根据菌株的溶原性、对溶原噬菌体的敏感性、山梨醇发酵和溶血试验等生物学性状可将埃尔托弧菌分成１２个生物型。  

    噬菌体－生物分型：将噬菌体分型与生物分型结合起来，每个噬菌体又可分为几个生物型，即噬菌体－生物分型，如１ａ、１ｂ、８ｉ等。常见的流行株为噬菌体１～３型，生物型为ａ～ｄ，非流行株为噬菌体６～３２型，生物型为ｇ～ｌ。通过噬菌体－生物分型，可以了解该地区菌型组成和分布情况。 

４．血清学诊断

    多数病人在发病第５天（早的第３天）即出现抗体(凝集素、杀弧菌抗体)和抗毒抗体。抗体滴度在发病第８～２１天之间达高峰，而多数病人的高峰在１０～15天之间，并在三周后滴度开始下降。  

    杀弧菌抗体检测：多数采用平皿溶菌法、试管法和改良微量法。方法见中华人民共和国卫生部《霍乱防治手册》1987年。  

    抗毒抗体测定：多数采用ELISA法、反向被动血凝法、皮肤血渗透因子中和法等。我国一般都采用ELISA法测定霍乱抗毒抗体。方法见中华人民共和国卫生部《霍乱防治手册》1987年。

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